長鏈非編碼RNA 膀胱癌相關轉錄本1、癌癥易感性候選物9在惡性胸腔積液中的表達及診斷價值Δ

謝詩琪，石志浩，陳萍，李堅

江蘇大學附屬醫院呼吸與危重癥醫學科，江蘇 鎮江 212001

胸腔積液是由多種不同原因引起的胸膜疾病[1]，胸腔積液的病因診斷仍然是臨床醫師需面臨的一大挑戰[2]。根據病因胸腔積液可分為良性胸腔積液和惡性胸腔積液。惡性胸腔積液多來源于惡性腫瘤的胸膜轉移，僅少數是由于原發性胸膜腫瘤（惡性胸膜間皮瘤）所致，是滲出性胸腔積液第二大常見病因，胸腔積液多是晚期或轉移性惡性腫瘤的標志，多提示患者預后不良[3]。原發性肺癌是引起惡性胸腔積液最常見的原因，占所有惡性胸腔積液的50%以上，其次是乳腺癌（16.8%）和惡性淋巴瘤（11.5%）[4-6]。臨床和影像學表現可對胸腔積液病因診斷提供輔助信息，但不能作為確診依據。胸腔積液或胸膜組織標本檢出腫瘤細胞是診斷惡性胸腔積液的金標準，但胸腔穿刺胸腔積液脫落細胞檢測的陽性率尚不能令人滿意[7]，盡管胸腔鏡胸膜活檢對惡性胸腔積液的確診率超過90%[7-8]，但由于該操作為有創性檢查且對技術要求較高使其臨床使用受到一定局限。良惡性胸腔積液在治療方案及預后評估方面迥然不同，因此，早期鑒別診斷尤為重要。隨著近年來無創分子診斷技術的迅速發展，為臨床通過檢測胸腔積液標本中的腫瘤特異性分子標志物來診斷惡性胸腔積液提供了更多的選擇[9-10]。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類非編碼轉錄本，通常并不編碼蛋白質，其長度超過200 個核苷酸，參與調控腫瘤的發生發展過程，并在腫瘤的發生發展過程中常異常表達，lncRNA 能進入血液、胸腔積液等體液中穩定存在，可作為惡性腫瘤診斷和預后評估的生物標志物[11-13]。lncRNA 膀胱癌相關轉錄本1（bladder cancer-associated transcript 1，BLACAT1）在多種腫瘤患者的腫瘤組織和血清中表達明顯上調，有望成為診斷某些腫瘤的生物標志物[14]。lncRNA 癌癥易感性候選物9（cancer susceptibility candidate 9，CASC9）被認為可能成為部分腫瘤的治療靶點、診斷及預測預后的生物標志物，有可能用于部分腫瘤的診斷和治療過程中[15-16]。研究證實，臨床多采用多項腫瘤標志物聯合檢測來提高惡性腫瘤的診斷效能[17]，但目前關于BLACAT1 和CASC9 作為生物標志物在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值尚未見報道。因此，本研究選取良惡性胸腔積液患者為研究對象，應用實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）法檢測胸腔積液中BLACAT1 和CASC9 的表達水平，并與經典的腫瘤標志物癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和細胞角質蛋白19 片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）進行比較，探討上述腫瘤標志物在良惡性胸腔積液鑒別診斷中的價值，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年7 月至2021 年7 月江蘇大學附屬醫院收治的初治胸腔積液患者。納入標準：①惡性胸腔積液患者的原發腫瘤均經病理學檢查確診，包括纖維支氣管鏡活檢、胃鏡活檢、經胸腔穿刺肺活檢及區域淋巴結穿刺活檢；②惡性胸腔積液的性質最終經細胞學或組織病理學檢查確定，如胸腔積液脫落細胞學檢查及胸膜活檢；③良性胸腔積液的病因均通過綜合臨床表現、體征、實驗室檢查及影像學檢查進行診斷。排除標準：①接受過正規抗腫瘤治療；②嚴重肝腎功能不全；③多器官功能衰竭；④嚴重出血、凝血功能障礙；⑤認知水平低下或存在嚴重精神障礙。依據納入和排除標準，本研究共納入96 例胸腔積液患者，其中良、惡性胸腔積液患者各48 例。良性胸腔積液患者中男30 例，女18 例；年齡18～85 歲，平均（66.04±15.51）歲；疾病類型：結核性胸腔積液14 例，肺炎旁胸腔積液17 例，心功能不全6 例，低蛋白血癥3例，膿胸2 例，自發性液氣胸6 例。惡性胸腔積液患 者 中 男32 例，女16 例；年 齡33～94 歲，平 均（67.94±11.71）歲；疾病類型：肺癌46 例[肺腺癌43例，肺鱗狀細胞癌2 例，小細胞肺癌（small-cell lung cancer，SCLC）1 例]，食管癌1 例，乳腺癌1 例。兩組患者性別、年齡比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院倫理委員會批準通過，所有患者均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器

血漿總RNA 提取Trizol 試劑、互補DNA（complementary DNA，cDNA）逆轉錄試劑盒、實時熒光定量PCR 試劑盒均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司，提取RNA 過程中使用的氯仿、異丙醇、75%乙醇、DEPC 水均購自國藥集團化學試劑有限公司。QuantStudio?5 實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 胸腔積液標本采集和處理 通過胸腔穿刺術收集所有患者胸腔積液標本200 ml，乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝，30 min 內完成以下處理步驟：1060 r/min、4 ℃離心5 min，離心半徑為10 cm；棄上清留取沉淀，向沉淀中加入紅細胞裂解劑吹打混勻，靜置5 min，以520 r/min、4 ℃離心5 min，離心半徑為10 cm，如遇沉淀中血紅素含量較多時，該步驟可重復1 次；棄去上清液，加入磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）吹打混勻洗滌沉淀，以1060 r/min、4 ℃離心5 min，離心半徑為10 cm，同時根據情況可重復該步驟洗滌沉淀；最終留取沉淀加入1 ml的Trizol 液吹打混勻，轉移至新的離心管中，-80 ℃保存備用。另外留取10 ml胸腔積液標本采用酶聯免疫吸附試驗檢測CEA、CYFRA21-1 水平，CEA的 正 常 值 參 考 范 圍 為0～5 ng/ml，CYFRA21-1 的正常值參考范圍為0.21～7.00 ng/ml。

1.3.2 胸腔積液RNA 的提取及逆轉錄cDNA 的合成 將凍存標本室溫解凍，取500 μl 加入100 μl氯仿振蕩混勻后靜置5 min，采用低溫高速離心機12 275 r/min、4 ℃離心15 min，取200 μl 上層水相，加入等量異丙醇，上下顛倒混勻，室溫靜置10 min；然后12 275 r/min、4 ℃離心10 min，可見底部微量白色沉淀，棄上清液加入500 μl 75%乙醇上下混勻清洗沉淀，以7970 r/min、4 ℃離心5 min，留取沉淀，于室溫下干燥5～10 min 至無色透明，溶于適量DEPC 水，測定RNA 濃度及純度，-80 ℃保存備用。根據逆轉錄試劑盒說明書，于冰上配置20 μl 逆轉錄反應體系，逆轉錄條件為37 ℃5 s，85 ℃15 min，4 ℃隨機，合成cDNA 放置于-20 ℃保存備用。

1.3.3 實時熒光定量PCR 法檢測胸腔積液中BLACAT1、CASC9 的 相 對 表 達 量 取2 μl 的cDNA 作為引物模板，于冰上配置20 μl 反應體系，PCR 反應條件：95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火和延伸5 s，共40 個循環。每個樣本設置3 個復孔，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參，采用2-ΔΔCT法計算BLACAT1、CASC9 的相對表達量。引物序列見表1。

表1 基因引物序列

1.4 統計學方法

采用SPSS 25.0軟件對所有數據進行統計分析，采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗對所有數據進行正態性檢驗，正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，非正態分布計量資料以中位數（四分位數間距）[M（P25，P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC），評估CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 單獨及聯合檢測對惡性胸腔積液的診斷效能，兩個及以上的腫瘤標志物聯合檢測對惡性胸腔積液診斷效能的評估采用逐步Logistic 回歸分析方法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BLACAT1、CASC9 相對表達量的比較

惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9 的相對表達量均明顯高于良性胸腔積液，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 良惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9 相對表達量的比較[M（P25，P75）]

2.2 不同臨床特征腫瘤患者惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9 相對表達量的比較

不同年齡、性別、吸煙情況、病理類型及有無糖尿病或心血管疾病腫瘤患者惡性胸腔積液中BLACAT1 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。不同性別、吸煙情況、病理類型及有無糖尿病或心血管疾病腫瘤患者惡性胸腔積液中CASC9 相對表達量比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；年齡＞65 歲腫瘤患者惡性胸腔積液中CASC9 的相對表達量高于年齡≤65 歲患者，差異有統計學意義（Z=-2.204，P=0.028）。（表3）

表3 48例不同臨床特征腫瘤患者惡性胸腔積液中BLACAT1、CASC9的相對表達量

2.3 CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 單獨及聯合檢測對惡性胸腔積液的診斷效能

CEA 單獨檢測診斷惡性胸腔積液的AUC為0.918（95%CI：0.863～0.974），高 于BLACAT1、CASC9、CYFRA21-1 單獨檢測，此時的靈敏度、特異度分別為87.2%、81.2%。BLACAT1+CASC9+CEA 聯合檢測診斷惡性胸腔積液的AUC 為0.938（95%CI：0.888～0.989），高于BLACAT1+CASC9、BLACAT1+CASC9+CYFRA21-1 聯合檢測的AUC，此時的靈敏度、特異度分別為91.5%、81.2%。（圖1、表4）

表4 CEA、CYFRA21-1、BLACAT1、CASC9 單獨及聯合檢測對惡性胸腔積液的診斷效能

圖1 BLACAT1、CASC9、CEA和CYFRA21-1單獨及聯合診斷惡性胸腔積液的ROC曲線

3 討論

惡性胸腔積液是腫瘤患者的常見并發癥，約15%的腫瘤患者疾病進展過程中會出現惡性胸腔積液[3]，其中10%以胸腔積液癥狀為首發表現，常預示著腫瘤已進展至晚期[18]。胸腔積液或胸膜組織標本檢出腫瘤細胞或腫瘤組織即可確診惡性胸腔積液，但一項前瞻性研究顯示，胸腔穿刺胸腔積液脫落細胞學檢測對惡性胸腔積液陽性檢出率為46%[7]，閉式胸膜活檢通常并不能進一步提高惡性胸腔積液的陽性檢出率[3,19]。近年來，腫瘤生物標志物在腫瘤診斷中的應用價值逐漸引起臨床的重視[20]，胸腔積液中高靈敏度、高特異度的腫瘤標志物檢測陽性可以盡早提示胸腔積液的惡性性質，有助于早確診、早處理以改善患者的預后。

BLACAT1基因定位于人類染色體1q32.1，發揮致癌基因的作用，在多種類型的腫瘤組織中異常表達，能夠通過各種機制促使腫瘤的惡性進展[21]。研究發現，BLACAT1 在包括肺腺癌、乳腺癌及食管癌等12 種腫瘤患者血清中的表達情況與腫瘤組織相似，BLACAT1 在這12 種腫瘤患者的血清及腫瘤組織中的表達水平均明顯高于對照組，血清BLACAT1 對這些腫瘤的診斷效能較高[14]。Xu 等[22]研究顯示，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）組織中BLACAT1 高表達患者的總生存期和無進展生存期均明顯短于低表達患者；體外實驗證實，BLACAT1 高表達促進了NSCLC 細胞的生長、遷移、轉移及上皮-間充質轉化。一項Meta分析顯示，BLACAT1 在腫瘤組織中的表達水平可作為肺癌、食管癌等多種腫瘤患者預后的生物標志物，BLACAT1 高表達與患者較短的生存期、較低的組織學分級、較晚的臨床分期及淋巴結轉移有關[23]。Chen 等[24]的 研 究 發 現，BLACAT1 在SCLC組織和細胞中的表達均明顯上調，其表達水平與腫瘤臨床分期、淋巴結轉移、遠處轉移及預后不良密切相關。另有研究發現，BLACAT1 在阿法替尼耐藥NSCLC 細胞中表達上調，下調BLACAT1 的表達可通過調節信號轉導與轉錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）信號通路逆轉NSCLC細胞對阿法替尼的耐藥性[25]。上述研究均證實，BLACAT1 可作為多種腫瘤診斷和預后評估的生物標志物，并可能作為某些腫瘤的治療靶點。本研究結果顯示，BLACAT1 在惡性胸腔積液（大多數來源于肺癌的胸膜轉移）中的相對表達量明顯高于良性胸腔積液，提示胸膜上轉移的腫瘤細胞產生的BLACAT1 釋放到了胸腔積液中，從而使檢測胸腔積液BLACAT1 作為診斷惡性胸腔積液的生物標志物成為可能，ROC 曲線結果顯示，BLACAT1 診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度和準確度均較高，具有良好的診斷效能。

有研究最早在食管鱗狀細胞癌中檢測到了CASC9 高表達，隨后又在多種惡性腫瘤中檢測到CASC9 的表達異常升高，被證實CASC9具有原癌基因的作用[26]。Zhao 等[27]的研究結果顯示，CASC9在NSCLC 組織和細胞系中表達上調，CASC9 高表達NSCLC 患者的總生存期明顯短于CASC9 低表達患者；體外實驗證實，CASC9 可通過調控miRNA-335-3p/S100A14 信號通路促進NSCLC 細胞的增殖、遷移和侵襲。有研究顯示，CASC9 在NSCLC 組織中高表達，ROC 曲線分析結果表明，CASC9 診 斷NSCLC 的AUC 為0.734（95%CI：0.669～0.799），提示其可能作為診斷NSCLC 的潛在標志物；進一步分析結果表明，CASC9 高表達與NSCLC 患者的病理類型、TNM 分期、預后密切相關[28]。本研究結果顯示，CASC9 在惡性胸腔積液中的相對表達量明顯高于良性胸腔積液；ROC 曲線分析結果顯示，CASC9診斷惡性胸腔積液的靈敏度、特異度均較高，具有良好的診斷效能，與申燕[28]的研究結果一致。

研究表明，多項腫瘤標志物聯合檢測能提高惡性胸腔積液的診斷效能[29]，本研究結果也證明了這一點。BLACAT1+CASC9 聯合檢測診斷惡性胸腔積液的AUC 高于二者單獨檢測，同時靈敏度、準確度均較高。BLACAT1+CASC9 與CEA 聯合檢測進一步提高了惡性胸腔積液的診斷效能，雖然包括lncRNA 在內的腫瘤標志物不是診斷惡性胸腔積液的金標準，但胸腔積液中異常升高的腫瘤標志物則高度提示惡性胸腔積液可能，有助于臨床醫師進一步深入檢查以盡早獲取細胞學或組織學證據。

綜上所述，BLACAT1、CASC9 在惡性胸腔積液中表達明顯上調，對惡性胸腔積液具有較好的診斷效能，BLACAT1+CASC9 與CEA 聯合檢測能夠進一步提高診斷效能。