乏氧條件下組蛋白去乙酰化酶6 對肝癌細胞增殖轉移能力的影響△

牛林軍，柳昂，王亞，李心忠，顧玉明#

1徐州醫科大學淮北臨床學院，安徽 淮北 235000

2淮北市人民醫院腫瘤科，安徽 淮北 235000

3徐州醫科大學附屬醫院介入科，江蘇 徐州 221002

原發性肝癌是中國常見的惡性腫瘤之一，病死率居所有惡性腫瘤第二位[1]。盡管目前肝癌的治療方法已明顯改善，特別是近年來抗血管生成藥物及免疫治療的應用，明顯延長了晚期肝癌患者的生存期，但總體治療效果仍差強人意。因此，尋找一種新的肝癌治療方法尤為重要。人類實體瘤內多存在局部乏氧的微環境，在腫瘤細胞的生長過程中發揮重要作用[2]。乏氧會影響葡萄糖轉運蛋白1（glucose transporter 1，GLUT1）和表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）等蛋白的表達及運輸，增強腫瘤細胞的侵襲性[3]。組蛋白去乙酰化酶6（histone deacetylase 6，HDAC6）是組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）家族成員，蛋白質的乙酰化和去乙酰化在多種生理和病理過程中發揮作用[4]。本研究檢測肝癌患者肝癌組織及相應癌旁組織中HDAC6 的蛋白表達情況，并探討肝癌細胞乏氧條件下HDAC6 的變化及對細胞增殖、轉移能力的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015 年11 月至2019 年11 月淮北市人民醫院和徐州醫科大學附屬醫院收治的肝癌患者。納入標準：①均經術后病理學檢查證實為肝細胞肝癌，簡稱肝癌；②術前未接受任何抗腫瘤治療；③病歷資料完整。排除標準：①肝膽管細胞癌；②術前接受過抗腫瘤治療。依據納入和排除標準，本研究共納入46 例肝癌患者，其中男28 例，女18例；年齡30～69 歲，中位年齡53 歲。選取46 例肝癌患者的新鮮肝癌組織及相應的癌旁組織，癌旁組織取自距肝癌組織邊緣2 cm 以外的正常肝臟組織，經10%甲醛溶液固定后石蠟包埋，切成4 μm厚的連續石蠟切片備用。

1.2 細胞、主要試劑和儀器

人肝癌HepG2 細胞購自上海中科院生命科學研究院。HDAC6小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）購自蘇州吉瑪公司，胎牛血清購自杭州四季青生物科技有限公司，RNA 提取試劑Trizol購自美國Invitrogen 公司，實時逆轉錄聚合酶鏈反應（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本TaKaRa 公司，免疫組織化學試劑盒、濃縮型二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術有限公司。Matrigel 購自美國BD 公司，細胞侵襲培養板購自美國Corning 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養、轉染和分組 人肝癌HepG2 細胞用含10%滅活胎牛血清的DMEM 培養基培養，分別置入常氧及乏氧細胞培養箱，設置細胞生長條件，常氧環境：37 ℃、21%O2、5%CO2；乏氧環境：37 ℃、3%O2、5%CO2。待乏氧培養的細胞融合至50%～70%時按試劑盒說明書將HDAC6siRNA 轉染至乏氧人肝癌HepG2 細胞，作為Hp-siHDAC6組，轉染過程通過Silentfect 介導；將未轉染的乏氧人肝癌HepG2細胞作為乏氧對照組，即Hp組；將常氧人肝癌HepG2細胞作為常氧對照組，即NC組。

1.3.2 實時熒光定量RT-PCR 法檢測HDAC6mRNA 的相對表達量 按照Trizol 試劑說明書提取肝癌組織和癌旁組織、各組人肝癌HepG2 細胞的總RNA，紫外分光光度計檢測其濃度及吸光度A260/A280比 值。提 取2 μg 總RNA，按 照Prime-ScriptTMRT Master Mix 逆轉錄試劑盒說明書合成互補DNA（complementary DNA，cDNA），然后通過7500 型熒光定量PCR 儀進行熒光定量PCR 反應，PCR 反應體系為10 μl，反應條件：95 ℃預變性30 s、95 ℃變性5 s、60 ℃退火34 s，共40 個循環；融解曲線分析：95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為 內 參，采 用2-ΔΔCT計 算HDAC6mRNA 的相對表達量，每組均設3 個復孔。HDAC6上游引物：5'-GGCTTCAGTTTCCTGTGCTC- 3'，下 游 引 物 ：5'- CTTCCTCCTCGCTCTCCTCT- 3'；GAPDH上 游 引 物 ：5'-GCAAATTCCATGGCACCGT-3'，下游引物：5'-TCGCCCCACTTGATTTTG-3'。

1.3.3 免疫組化法檢測HDAC6 蛋白的表達情況鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶（streptavidin-peroxidase，SP）法操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，4 μm 厚組織切片常規進行脫蠟、梯度乙醇水化。在抗原修復液中95～99 ℃處理40 min，室溫冷卻20 min。清洗3 次后，分別加入1∶50 稀釋的HDAC6 一抗4 ℃孵育過夜。然后應用EnVision 檢測和顯色試劑盒進行DAB 顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，然后樹膠封片觀察。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）替代一抗作為陰性對照，用已知陽性切片作為陽性對照。結果判定：每張切片高倍鏡（×400）下隨機選取10 個視野，每個視野計數100 個細胞，計算陽性細胞百分比，取平均值，以細胞質內出現棕黃色顆粒為陽性細胞，根據陽性細胞百分比及染色強度進行評分：陽性細胞百分比＜5%計0 分，陽性細胞百分比為5%～24%計1 分，陽性細胞百分比為25%～49%計2分，陽性細胞百分比為50%～75%計3分，陽性細胞百分比＞75%計4 分；無著色計0 分，淺棕黃色染色計1分，棕黃色染色計2分，棕褐色染色計3分；將陽性細胞百分比和染色強度評分相乘，≤4分判定為HDAC6陰性表達，＞4分判定為陽性表達。

1.3.4 CCK8 檢測人肝癌HepG2 細胞增殖能力將3 組人肝癌HepG2 細胞用胰蛋白酶消化并計數，接種于96 孔板中，每組細胞設5 個復孔。鋪好96孔板后將培養板置于培養箱中培養，分別轉染24、48、72、96 h 后，每孔加入10 μl 的CCK8 溶液。將96 孔板在培養箱內孵育，分別在加入CCK8 后0.5、1.0、2.0、4.0 h 時用酶標儀測定450 nm 處的光密度（optical density，OD）值。重復實驗3 次。

1.3.5 Transwell 實驗檢測人肝癌HepG2 細胞遷移、侵襲能力 取3 組人肝癌HepG2 細胞，在遷移實驗中，Transwell 小室的上室加入200μl 無血清培養基重懸細胞，含有2×104個細胞，Transwell 小室的下室加入含600 μl 的10%胎牛血清培養液。侵襲實驗中，應用基質膠（Matrigel 膠，比例為1∶8）包被Transwell 小室的微孔膜，放入37 ℃培養箱中培養48 h 后取出Transwell 小室，多聚甲醛固定，結晶紫染色，用棉簽擦去小室上層未穿膜細胞，顯微鏡下拍照，隨機取5 個不同的視野（×200）計數，計算遷移、侵襲細胞的平均數。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件對所有數據進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗；計數資料以例數和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肝癌組織及癌旁組織中HDAC6 mRNA 相對表達量的比較

肝癌患者肝癌組織中HDAC6mRNA 的相對表達量為（0.44±0.05），明顯低于癌旁組織的（0.75±0.08），差異有統計學意義（t=5.054，P=0.007）。

2.2 肝癌組織及癌旁組織中HDAC6 蛋白陽性表達率的比較

肝癌患者肝癌組織中HDAC6 蛋白陽性表達率為34.78%（16/46），明顯低于癌旁組織的73.91%（34/46），差 異 有 統 計 學 意 義（χ2=14.194，P＜0.01）。肝癌組織中HDAC6 蛋白多呈低表達或陰性表達，而癌旁組織多表現為細胞質內均勻分布的棕黃色顆粒。（圖1）

圖1 肝癌患者肝癌組織及癌旁組織中HDAC6蛋白的表達情況（SP染色，×400）

2.3 不同臨床特征肝癌患者肝癌組織中HDAC6蛋白表達情況的比較

不同性別、年齡、腫塊數目肝癌患者肝癌組織中HDAC6 陽性表達率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；腫瘤直徑≥5 cm、術前甲胎蛋白（α-fetal protein，AFP）水平≥400 ng/ml、分化程度為低分化、TNM 分期為Ⅲ+Ⅳ期的肝癌患者肝癌組織中HDAC6 陽性表達率分別低于腫瘤直徑＜5 cm、術前AFP 水平＜400 ng/ml、分化程度為中高分化、TNM 分期為Ⅰ+Ⅱ期的患者，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

表1 不同臨床特征肝癌患者肝癌組織中HDAC6 蛋白表達情況的比較（n=46）

2.4 人肝癌HepG2 細胞中HDAC6 mRNA 相對表達量的比較

NC 組、Hp 組及Hp-siHDAC6 組人肝癌HepG2細胞中HDAC6mRNA 的相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.01），其中Hp 組和Hp-siHDAC6組細胞中HDAC6mRNA 的相對表達量均明顯低于NC 組，Hp-siHDAC6 組細胞中HDAC6mRNA 的相對表達量明顯低于Hp 組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表2）

表2 3 組人肝癌HepG2 細胞中HDAC6 mRNA 相對表達量的比較（±s）

表2 3 組人肝癌HepG2 細胞中HDAC6 mRNA 相對表達量的比較（±s）

注：a與NC組人肝癌HepG2細胞比較，P＜0.01；b與Hp組人肝癌HepG2細胞比較，P＜0.01

組別NC組Hp組Hp-siHDAC6組F值P值HDAC6 mRNA相對表達量0.66±0.04 0.44±0.05a 0.25±0.02ab 77.965＜0.01

2.5 干擾HDAC6 的表達對人肝癌細胞增殖能力的影響

轉染24 h，3 組人肝癌HepG2 細胞OD 值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。轉染48、72、96 h后，3 組人肝癌HepG2 細胞OD 值比較，差異均有統計學意義（F=9.880、96.034、33.911，P＜0.05）；Hp 組和Hp-siHDAC6 組細胞的OD 值均明顯高于NC組，Hp-siHDAC6 組細胞OD 值均明顯高于Hp 組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表3）

表3 不同轉染時間3組人肝癌HepG2細胞OD值的比較（±s）

表3 不同轉染時間3組人肝癌HepG2細胞OD值的比較（±s）

注：a與同時間NC組人肝癌HepG2細胞比較，P＜0.01；b與同時間Hp組人肝癌HepG2細胞比較，P＜0.01

時間（h）24 48 72 96

2.6 干擾HDAC6 的表達對人肝癌HepG2 細胞遷移、侵襲能力的影響

NC 組、Hp 組及Hp-siHDAC6 組人肝癌HepG2細胞中細胞遷移數、細胞侵襲數比較，差異均有統計學意義（P＜0.01），其中Hp 組和Hp-siHDAC6 組細胞遷移數、細胞侵襲數均明顯高于NC 組，Hp-si-HDAC6 組細胞遷移、細胞侵襲數均明顯高于Hp組，差異均有統計學意義（P＜0.01）。（表4、圖2）

圖2 Transwell實驗檢測干擾HDAC6的表達對3組人肝癌HepG2細胞遷移、侵襲能力的影響（結晶紫染色，×200）

表4 3 組人肝癌HepG2 細胞遷移和侵襲數目的比較（±s）

表4 3 組人肝癌HepG2 細胞遷移和侵襲數目的比較（±s）

注：a與NC組人肝癌HepG2細胞比較，P＜0.01；b與Hp組人肝癌HepG2細胞比較，P＜0.01

組別NC組Hp組Hp-siHDAC組F值P值細胞遷移數52.71±6.00 95.34±4.99a 118.30±6.03ab 116.828＜0.01細胞侵襲數60.51±4.74 98.97±8.79a 120.16±3.98ab 69.961＜0.01

3 討論

乏氧是腫瘤微環境形成最重要的因素之一。在乏氧條件下，腫瘤可通過多種調節機制使自身腫瘤細胞更具抵抗力和存活能力。腫瘤細胞可通過調節缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）來促進腫瘤細胞的生長[2]。HDAC 是一類能夠對染色體的結構修飾和基因表達調控發揮重要作用的蛋白酶。其中HDAC6 在自體吞噬、細胞應激反應、細胞周期進程、細胞凋亡和腫瘤新生血管生成過程中發揮重要的調節作用[5-7]。目前關于HDAC6 在肝癌中作用的研究較少，且存在較大分歧[8-9]。本研究支持HDAC6在肝癌細胞中發揮抑癌基因的作用。

乏氧能夠促進腫瘤新生血管生成，增強腫瘤細胞的侵襲能力并影響相關蛋白的運輸。相關研究表明，乏氧可以導致肝癌細胞HDAC6 蛋白的相對表達量明顯降低[10-11]，并通過磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3- kinases，PI3K）/蛋 白 激 酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）通路參與新生血管生成[12-13]。PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）通路是哺乳動物細胞自噬非常重要的信號轉導通路之一，其通過影響下游多種效應分子的活化狀態，發揮抑制細胞凋亡、促進細胞增殖的作用。有研究表明，PI3K/AKT/MTOR 通路能夠促進肝癌細胞的生長并提高其黏附能力[14]。PI3K 通路能被細胞膜上的各種酪氨酸激酶受體（receptor tyrosine kinase，RTK）所激活[15]，血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）是RTK 家族成員，干擾下調HDAC6 的表達后，VEGFA 水平可明顯升高[11]。HDAC6 可以調節RAS 通路，RAS基因能上調血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達，促使腫瘤新生血管生成，促進腫瘤細胞的生長[16-17]。由此可以推測，HDAC6 可能通過介導RAS 或直接激活VEGFA/PI3K/AKT 信號通路來調節肝癌細胞的遷移、侵襲能力，但這需要進一步的研究進行驗證。

本研究結果顯示，肝癌組織中HDAC6 蛋白的陽性表達率、HDAC6mRNA 的相對表達量均明顯低于癌旁組織，這可能與肝癌組織的乏氧環境有關。此外，HDAC6 蛋白的陽性表達率可能與腫瘤直徑、術前AFP 水平、分化程度、TNM 分期有關，腫瘤直徑越大、術前AFP 水平越高、分化程度越低、TNM 分期越晚，HDAC6 的陽性表達率越低。本研究通過人肝癌HepG2 細胞發現，乏氧條件下可以增強肝癌細胞增殖能力并通過下調HDAC6的表達來調節肝癌細胞的生長，但具體的作用機制尚需進一步的研究。這些結果對于明確乏氧環境對肝癌細胞的作用及其可能的機制奠定了基礎，也為肝癌的治療提供了潛在的方向。

綜上所述，乏氧條件下HDAC6基因能夠抑制肝癌細胞的增殖及轉移，有望為肝癌的治療提供新的靶點。