超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀分析水中的微囊藻毒素LR和RR

壽 婕，董建淼，潘月燕

（1.浙江省紹興生態(tài)環(huán)境監(jiān)測中心，浙江 紹興 312000；2.浙江中諾檢測技術(shù)有限公司，浙江 紹興 312000；3.浙江大工檢測研究有限公司，浙江 紹興 312000）

微囊藻毒素是常見的藍藻毒素，是由藍藻水華等爆發(fā)所產(chǎn)生的一種單環(huán)七肽物質(zhì)，具有多器官毒性、遺傳毒性、神經(jīng)毒性、免疫毒性和潛在的促癌性，并能引起受試生物發(fā)育異常，微囊藻毒素對水體環(huán)境和人體健康的危害已成為全球關(guān)注的重大環(huán)境問題之一。微囊藻毒素具有水溶性和耐熱性，加熱煮沸都不能將毒素破壞，自來水處理工藝的混凝沉淀、過濾、加氯、氧化、活性炭吸附等也不能將其完全去除。微囊藻毒素易溶于水、甲醇或丙酮，不揮發(fā)，抗pH變化，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，自然降解過程十分緩慢。微囊藻毒素在去離子水中可保持穩(wěn)定狀態(tài)長達27天，在滅菌的河水中可保持穩(wěn)定12天，而在普通河水中可穩(wěn)定7天。

隨著濃縮、富集、分離方法和儀器技術(shù)的進步，定量分析微囊藻毒素的方法也在不斷進步，且應(yīng)用越來越廣泛。液質(zhì)聯(lián)用法（LC-MS）以液相色譜為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)。微囊藻毒素樣品在質(zhì)譜部分和流動相分離，被離子化后，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將離子碎片按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖[1]。所以只要知道相對分子質(zhì)量，就可以對樣品進行精確的定量檢測?！兜乇硭h(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（GB3838-2002）中規(guī)定了微囊藻毒素LR的標(biāo)準(zhǔn)限值為1 μg/L，本文采用固相萃取對水樣進行富集，超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜對目標(biāo)物進行定量分析，檢出限能夠滿足地表水標(biāo)準(zhǔn)限值。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜儀（Waters premier，Waters公司）；全自動固相萃取儀；HLB固相萃取柱；Caliper樣品自動濃縮儀。

甲醇（美國Fisher試劑公司色譜純試劑）；甲酸（美國Fisher公司色譜純）；微囊藻毒素LR的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批號是ALX-350-043 L29994，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量為100 μg；微囊藻毒素RR的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)批號是ALX-350-012 L29995，該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量為100 μg。

1.2 水樣預(yù)處理條件及步驟

1.2.1 柱活化及條件化

先用15 mL甲醇活化柱子，再用15 mL水移去活化試劑。柱活化及條件化流速為5.0 mL/min。

1.2.2 上樣

設(shè)定上樣體積為505 mL（水樣500 mL+5 mL甲醇，設(shè)定多的體積是為了保證上樣瓶里的水樣能夠完全進樣），以5.0 mL/min的流速使水樣全部通過HLB柱，上樣結(jié)束后用15 mL 5%甲醇水以5.0 mL/min沖洗柱子，去除水溶性干擾物。吹氮氣15分鐘使HLB柱徹底干燥。

1.2.3 洗脫

用10 mL甲醇洗脫HLB柱，收集洗脫液，洗脫劑流速為1.0 mL/min。

1.2.4 濃縮

用甲醇沖洗收集管，將洗脫液合并后，在Caliper樣品自動濃縮儀上濃縮到0.5 mL，再加入1.5 mL 50%甲醇水進行溶劑置換，最后定容至1.0 mL，供超高效液相色譜——三重四級桿質(zhì)譜測定。

1.3 超高效液相色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱，ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm 2.1×50 mm）；柱溫40 ℃；流動相采用甲醇和0.1%甲酸水溶液[2]；等度洗脫；流速0.40 mL/min；進樣量10 uL。

質(zhì)譜條件：電噴霧正離子模式（ESI+）；質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取小柱

選擇了C18柱、活性炭小柱、HLB小柱進行分析，結(jié)果表明只有HLB小柱能滿足需要，其他2種柱子的回收率都比較低。因此確定用HLB柱來富集水中的微囊藻毒素。

2.2 液相條件的優(yōu)化

色譜柱的選擇：比較了兩種色譜柱，分別是C18色譜柱[3]（1.7 μm 2.1×50 mm），T3色譜柱（1.8 μm 2.1×50 mm）。實驗表明，C18色譜柱對微囊藻毒素有較好的柱效，因此選擇了C18色譜柱。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

用1 mL甲醇分別溶解LR和RR標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)粉末，配成100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍分別移取100 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液到10 mL容量瓶，用純甲醇定容至刻度線，配成1 000 μg/L的LR和RR標(biāo)準(zhǔn)混合使用液。

用移液槍移取標(biāo)準(zhǔn)混合使用液50 μL、80 μL、100 μL、150 μL、200 μL至waters進樣瓶，用50%甲醇水定容到1.0 mL，制作低濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1。

表1 微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定結(jié)果

用移液槍移取標(biāo)準(zhǔn)混合使用液200 μL、250 μL、300 μL、400 μL、500 μL、600 μL至waters進樣瓶，用50%甲醇水定容到1.0 mL，制作高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表2。

表2 微囊藻毒素-LR和微囊藻毒素-RR標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定結(jié)果

2.4 方法檢出限

在測定檢出限時，最少測定七個重復(fù)的低濃度加標(biāo)樣品，加標(biāo)的濃度要適宜，一般為預(yù)期值的3～5倍，再根據(jù)測定結(jié)果計算出標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3.143倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為方法檢出限。

本方法分別用七個0.10 μg/L的500 mL模擬水溶液進行平行試驗，結(jié)果如表3。微囊藻毒素-LR的檢出限為0.017 μg/L，微囊藻毒素-RR的檢出限為0.060 μg/L。

表3 微囊藻毒素-LR和RR方法檢出限結(jié)果

2.5 精密度與回收率實驗

2.5.1 精密度實驗結(jié)果

配制濃度為0.16 μg/L和0.9 μg/L的微囊藻毒素LR和RR模擬水溶液，進行精密度試驗，結(jié)果如表4。結(jié)果表明，高、低濃度的微囊藻毒素模擬水溶液的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，能夠滿足地表水水質(zhì)分析的需要。

表4 微囊藻毒素-LR和RR的精密度實驗結(jié)果（μg/L）

2.5.2 回收率實驗結(jié)果

取純水樣品，加入不同體積的微囊藻毒標(biāo)準(zhǔn)溶液，形成高、低濃度的加標(biāo)樣品，按實驗步驟分別進行6次測定，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，微囊藻毒素-LR的加標(biāo)回收率范圍為70.5%～76.1%，微囊藻毒素-RR的加標(biāo)回收率范圍為72.8%～87.5%。

表5 微囊藻毒素-LR和RR加標(biāo)回收率實驗結(jié)果

3 結(jié)論

利用HLB小柱對水樣中的微囊藻毒素進行富集凈化，用甲醇和甲酸為流動相，通過優(yōu)化前處理及檢測條件，用超高效液相色譜-三重四級桿質(zhì)譜檢測地表水中微囊藻毒素，該方法避免衍生等繁瑣步驟，方法靈敏度高，能夠滿足實際工作需求。在50-600 μg/L范圍內(nèi)，有很好的線性相關(guān)性，微囊藻毒素LR方法的檢出限為0.017 μg/L，能夠滿足我國地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中微囊藻毒素LR的濃度限值檢測要求。