蘇尼特羊宰后成熟過程中單磷酸腺苷活化蛋白激酶活性、糖酵解與肉品質指標的變化分析

楊致昊，劉 暢，竇 露，侯艷茹，陳曉雨，蘇 琳，趙麗華，靳 燁*

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010018）

冷鮮肉是指動物屠宰后將胴體迅速進行冷卻，使胴體溫度降為0～4 ℃，并在此溫度下加工、貯運、銷售的肉類。冷鮮肉經歷了比較充分的解僵-成熟過程，同時，在低溫環境下肉的表面形成一層干的油脂膜，不僅能夠減少肌肉內部的水分蒸發，使肉質柔軟多汁，而且可阻止微生物的侵入和繁殖，延長肉的保藏時間。羊肉在經過充分的成熟后，肉質變得柔軟且有彈性、色澤鮮艷、口感好。此外，肉品本身含有一定的風味物質前體化合物，在成熟過程中發生一系列的化學變化，能夠顯著提高肉的風味和整體接受度。李桂霞等對宰后羊肉品質進行研究，結果發現，與宰后1 d的肉相比，成熟7 d的羊肉亮度提升，剪切力下降；保水性則隨著宰后成熟時間的延長而降低。楊文婷等對羊宰后背最長肌的研究也得出了類似的結論。Bruce等研究發現，經歷了宰后成熟的牛肉具有特殊的咸味或燒烤香味。而這一系列變化都可能與宰后機體內單磷酸腺苷活化蛋白激酶（monophosphateactivated protein kinase，AMPK）被激活有關。

羊屠宰后，機體內氧氣供應中斷，各種需氧型生物化學反應變為無氧型生物化學反應，造成動物體內的ATP含量急劇減少，導致AMP與ATP比值增大，從而激活了AMPK。作為真核細胞的能量感受器，AMPK參與調控宰后肌肉的能量代謝，尤其是糖酵解途徑。研究發現糖酵解與肉色、pH值、嫩度和風味等肉質性狀密切相關。宰后肉AMPK活力的高低會直接影響pH值下降的快慢，進而影響肉品的色澤、持水性等指標。研究表明，處于饑餓應激下的綿羊，宰后肉的AMPK活力增加、糖原含量減少、乳酸濃度和剪切力增加。

本實驗以蘇尼特羊為研究對象，通過對宰后羊肉AMPK含量和活性的變化規律進行研究，探討宰后羊肉AMPK的含量與活性對宰后羊肉糖酵解和成熟進程的影響，明確AMPK含量和活性的變化與肌肉品質的關系，確定蘇尼特羊宰后最佳的成熟時間，旨在為研究羊宰后肌肉的生理變化提供數據支持，進而為改善冷鮮羊肉品質提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘇尼特羊購自內蒙古巴彥淖爾市烏拉特中旗哈拉圖嘎查順遂農牧農業合作社。

綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（p-AMPK）含量酶聯免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、綿羊磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶（phosphorylated AMPK，p-AMPK）活力ELISA試劑盒江蘇酶免實業有限公司；肌糖原含量試劑盒（A043-1-1）、乳酸（A019-2-1）含量試劑盒 南京建成生物工程研究所；葡萄糖含量檢測試劑盒（BC2505） 北京Solarbio科技有限公司。

1.2 儀器與設備

C-LM3B嫩度儀 北京天翔飛域儀器設備有限公司；CR-400型色差儀 日本柯尼卡美能達公司；pH-STAR型胴體直測式pH計 北京賽多利斯科學儀器有限公司；XHF-DY型高速分散器 寧波新芝生物科技股份有限公司；5810-R型低溫臺式冷凍離心機 德國Eppendorf公司；TU-1810型紫外-可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司；Trace1300、ISQ型氣相色譜-質譜（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）聯用儀美國賽默飛世爾科技公司；固相微萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的前處理

選取6只健康無病體質量相近的蘇尼特羊，屠宰后取背最長肌分為5等份，在4 ℃條件下進行宰后成熟。在宰后的0、24、48、72、96 h分別測定pH值、剪切力和色澤。同時在每個時間點取2 g左右樣品置于無菌無酶管于液氮中存放，之后轉移到實驗室并于－80 ℃冰箱中保存，用于后續指標的測定。另取100 g左右的樣本，在－20 ℃條件下冷凍保存，用于揮發性風味物質的測定。

1.3.2 p-AMPK質量濃度與活力測定

分別取宰后0、24、48、72 h和96 h的肌肉樣品0.5 g，加入至4.5 mL的質量分數0.85%的生理鹽水，3 000 r/min冰浴勻漿。樣品充分勻漿后，3 000 r/min離心10 min，收集上清液利用相應試劑盒測定p-AMPK質量濃度與活力。

1.3.3 糖酵解相關指標測定

pH值的測定：使用pH-STAR型胴體直測式pH計進行測定，每個樣本測定3 次，記錄并取平均值。

肌糖原和乳酸含量測定：宰后0、24、48、72 h和96 h的肌肉樣品（0.5 g）中加入4.5 mL的質量分數0.85%鹽水，3 000 r/min冰浴勻漿。樣品充分勻漿后，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，收集上清液并利用相應試劑盒進行肌糖原和乳酸含量測定。

葡萄糖含量測定：稱取宰后0、24、48、72 h和96 h的肌肉樣品0.1 g，加入1 mL蒸餾水，研磨成勻漿，置于沸水浴中煮沸10 min（蓋緊，防止水分散失），冷卻后，8 500 r/min、25 ℃離心10 min，取上清液并利用相應試劑盒進行葡萄糖含量測定。

1.3.4 肉品質指標測定

1.3.4.1 剪切力的測定分別在宰后0、24、48、72 h和96 h取背最長肌，將沿肌纖維方向切好的肌肉組織用蒸煮袋封好，于85 ℃水浴鍋中加熱煮至肉的中心溫度為70 ℃，取出后用濾紙擦干表面水分并在室溫下冷卻。沿肌纖維方向將其切成3 cmh1 cmh1 cm形狀的肉塊，使用嫩度儀對每個樣品測定5～6 次剪切力，記錄并計算平均值。

1.3.4.2 蒸煮損失率的測定

分別在宰后0、24、48、72 h和96 h，將樣品單獨放入塑料袋中并記錄其煮前質量（/g），然后75 ℃水浴，數字溫度計測量中心溫度，達到70 ℃后保持20 min。晾至室溫后，擦干表面水分，記錄其煮后質量（/g）。蒸煮損失率按式（1）計算。

1.3.4.3 色澤的測定

分別在宰后0、24、48、72 h和96 h使用色差儀測定樣品的色差值（亮度*值、紅綠度*值、黃藍度*值），每個肉樣測定3 次，記錄并取平均值。

1.3.5 揮發性風味物質的測定

將宰后0、24、48、72 h和96 h的樣品解凍，切成肉糜（去除筋膜）后稱取5 g，置于20 mL采樣瓶中，將萃取頭插入采樣瓶中，60 ℃吸附40 min后取出，隨后插入GC進樣口，250 ℃解吸3 min。

GC-MS條件：TR-5色譜柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm），載氣為He；載氣流速1.0 mL/min；進樣品和接口溫度250 ℃；升溫程序為初始溫度40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升溫到200 ℃，保持5 min，再以20 ℃/min升溫到230 ℃，保持5 min，不分流進樣；離子源溫度250 ℃；保持5 min，再以20 ℃/min升溫到230 ℃，保持5 min，不分流進樣；離子源溫度250 ℃；傳輸線溫度250 ℃；質量掃描范圍/35～400；溶劑延遲1 min。

1.3.6 關鍵揮發性風味物質的確定

采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）法確定關鍵風味物質，定義對樣品風味貢獻最大的物質ROAV＝100，其他揮發性物質ROAV按式（2）計算。

式中：ROAV為相對氣味活度值；Cr為各揮發性物質的相對含量/%；T為各揮發性物質對應的感覺閾值；為對試樣總體風味貢獻最大物質的相對含量/%；為對試樣總體風味貢獻最大物質相對應的感覺閾值。所有物質均滿足0≤ROAV≤100，其中ROAV≥1為關鍵揮發性風味物質，ROAV越大的物質對樣品整體風味的貢獻也越大。

1.4 數據統計分析

利用SPSS 22.0軟件進行Duncan’s差異顯著性分析（以＜0.05表示差異顯著），并采用Excel 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 蘇尼特羊宰后成熟過程AMPK變化

羊屠宰后，機體內氧氣供應中斷，能量水平發生了改變，從而激活了AMPK，被激活的AMPK能夠參與調控機體糖代謝，進而影響肉品的剪切力、色澤和持水性等指標。p-AMPK能夠激活AMPK的級聯效應，因此用p-AMPK來表征AMPK。蘇尼特羊宰后成熟過程中p-AMPK質量濃度和活力變化分別如圖1、2所示。

圖1 蘇尼特羊宰后成熟過程中p-AMPK質量濃度的變化Fig.1 Variation in content of p-AMPK during post-mortem aging of Sunit lamb meat

圖2 蘇尼特羊宰后成熟過程中p-AMPK活力的變化Fig.2 Variation in p-AMPK activity during post-mortem aging of Sunit lamb meat

由圖1、2可知，蘇尼特羊宰后肌肉中p-AMPK的質量濃度和活力都呈現先上升后下降的趨勢，并在24 h達到最高。高永芳等的研究結果顯示宰后牛肉中的p-AMPK活力也呈現先上升后下降的趨勢，本實驗結果與其一致。動物被屠宰初期，機體缺少氧氣的供應，肌肉中的糖代謝方式由有氧氧化轉變為無氧酵解，造成動物體內ATP的含量急劇下降，AMP/ATP比值上升，這種狀態激活了AMPK，因此p-AMPK的質量濃度和活力升高。而隨著成熟時間的延長，無氧酵解產生了大量乳酸，導致pH值下降，當低于酶的最適pH值后，AMPK變性失活，p-AMPK的質量濃度和活性不斷下降。

2.2 蘇尼特羊宰后成熟過程糖酵解指標的變化

糖酵解在生物體內廣泛存在，被認為是對生物體具有重要意義的中心代謝途徑，動物屠宰后主要依靠糖酵解途徑分解糖原進行供能，而糖酵解的最終產物是乳酸，乳酸不斷地堆積引起肌肉pH值的變化。pH值是胴體成熟過程評價肉質的重要指標，宰后肌肉pH值下降速度和程度影響肌肉蛋白特性，進而對肉質產生影響。由表1可知，隨宰后成熟時間的延長，24 h內pH值顯著下降（＜0.05），24 h后變化趨于穩定，說明糖酵解反應幾乎終止，這與李文博等的研究結果一致。由表1可知，在宰后成熟過程中，肌糖原和游離葡萄糖含量整體呈現下降的趨勢。分析其原因主要是機體無法從外界獲取能量，同時AMPK受缺血、缺氧的刺激被激活，被激活的AMPK活化了糖原磷酸化酶，從而加快了肌糖原的分解，使得肌糖原含量不斷下降。李澤在羊肉中注射了AMPK專一激活劑5-氨基咪-4-甲酰胺核苷（5-amino-4-imidazolecarboxamide，AICAR）后發現，與對照組相比，注射AICAR能夠加快宰后成熟過程中肌肉糖酵解的進程。乳酸作為糖酵解的產物，其含量隨著成熟時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，在成熟24 h最高。0～24 h乳酸含量的增加是因為無氧條件下糖原通過糖酵解大量生成乳酸。而在48～96 h期間乳酸含量無顯著差異，可能是由于成熟后期糖原含量下降，糖酵解速率減緩。

表1 蘇尼特羊宰后成熟過程中糖酵解指標的變化Table 1 Variation in glycolysis indexes during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.3 蘇尼特羊宰后成熟過程肉品質指標的變化

2.3.1 剪切力

剪切力是肉嫩度最直接的反映，剪切力越大說明嫩度越差。動物被屠宰后經歷僵直、解僵和成熟的不同過程，剪切力也隨之發生變化。動物屠宰初期，肌球蛋白和肌動蛋白發生不可逆的結合，生成肌動球蛋白，引起永久性的肌肉收縮，結果形成外觀上僵硬（僵直）的狀態。隨著宰后成熟時間的延長，在一些內源酶的作用下，肌肉的結構被破壞，僵直解除，剪切力開始下降，肌肉成熟。由圖3可知，隨著宰后成熟時間的延長，剪切力先逐漸上升，且在24 h達到最大值，表明僵直主要發生在宰后0～24 h內，可能的原因是鈣蛋白酶體系在低pH值環境下活性低，不利于鈣蛋白酶發揮降解肌肉蛋白的活性，24 h后開始解僵，pH值升高，鈣蛋白酶活性升高，剪切力逐漸減小，Kannan等的研究結果也顯示羊在宰后24 h的剪切力最高，本研究結果與其相符。

圖3 蘇尼特羊宰后成熟過程中剪切力的變化Fig.3 Variation in shear force during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.3.2 蒸煮損失率

保水性是影響羊肉品質的關鍵因素，較低的蒸煮損失率可以在一定程度上反映羊肉有較好的保水性。由圖4可知，隨著宰后成熟時間的延長，羊肉的蒸煮損失率總體呈現先升高再降低再升高的變化趨勢，0～24 h的蒸煮損失率顯著低于宰后成熟的其他時間點（＜0.05），說明宰后24 h內的保水性好。宰后96 h蒸煮損失率達到最大值，可能是由于此時的pH值接近肌肉蛋白質的等電點，蛋白質產生了靜電荷效應，分子之間的靜電斥力減小，使其網狀結構處于緊縮狀態，肌肉內部空間變小，保水性降低。

圖4 宰后不同成熟時間蘇尼特羊肉蒸煮損失的變化Fig.4 Variation in cooking loss during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.3.3 色澤

肉的色澤是影響消費者購買行為和鮮肉貨架期的一個重要因素，是判斷肉品質的一個重要指標。肌肉顏色的深淺主要取決于肌肉中血紅蛋白和肌紅蛋白的含量和狀態，同時還與肌纖維的類型、狀態及水分分布有很大關系。由表2可知，*值在宰后96 h達到最大，可能是宰后pH值的變化造成的。宰后肌肉的pH值會下降到蛋白質等電點，使蛋白質分子不帶電，對水分子的吸引力下降，肌肉的保水性下降，水分滲出，堆積在肉塊表面，從而增強了光的反射。蘇尼特羊宰后成熟過程中*值及*值均呈現先升高后平緩的趨勢。*值在0～24 h顯著升高（＜0.05），分析其原因主要是肌肉中的肌紅蛋白與氧氣結合形成氧合肌紅蛋白，呈現出鮮紅的顏色。在96 h有下降趨勢，這是由于隨著成熟時間的延長，肌紅蛋白和氧氣充分接觸產生高鐵肌紅蛋白，高鐵肌紅蛋白呈暗紅色，使肉色變暗，*值降低。*值在0～24 h顯著升高的原因可能是肌肉與氧氣充分接觸后，肌肉中的脂肪被氧化，從而使*值增加。

表2 蘇尼特羊宰后成熟過程中羊肉色澤的變化Table 2 Variation in color parameters during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.4 蘇尼特羊宰后成熟過程中揮發性風味物質的變化

2.4.1 揮發性風味物質種類

揮發性風味物質是肉中香味的重要來源，其種類和含量是評價羊肉品質優劣的重要依據。本實驗中檢測出5 類揮發性風味物質，共計103種，其中醛類13種、醇類24種、酮類11種、烴類26種、其他類化合物29種。由圖5可知，宰后0、2、48、72 h和96 h的揮發性風味物質分別為29、30、41、40、46種，揮發性風味物質種類整體呈現升高的趨勢。這與Watanabe等測定牛肉成熟過程中揮發性風味物質的數量變化趨勢一致。呈現這種趨勢的可能原因是在宰后成熟過程中，AMPK被活化后迅速抑制乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）活性，降低ACC mRNA的表達從而減少脂肪酸合成，同時加速脂肪酸氧化過程，進而加速脂肪代謝。此外，機體內的風味前體物質如游離脂肪酸、氨基酸和核苷酸等會隨著脂肪氧化、蛋白水解等化學過程的變化而變化，其中釋放出來的某些短鏈游離脂肪酸會產生強烈的氣味，而中鏈和長鏈游離脂肪酸會進一步氧化，產生額外的揮發性風味物質，從而促進了揮發性風味物質的形成。

圖5 蘇尼特羊宰后成熟過程中揮發性風味物質種類Fig.5 Changes in composition of volatile flavor compounds during post-mortem aging of Sunit lamb meat

2.4.2 關鍵揮發性風味物質

本實驗檢測出的揮發性風味物質種類較多，但并非每種都對羊肉的風味形成起決定性作用，因此，采用ROAV法來確定羊宰后成熟過程中的關鍵揮發性風味物質，并結合各物質的氣味特性進行分析。表3為蘇尼特羊宰后不同時間的關鍵揮發性風味物質及相應ROAV。其中，ROAV≥1的物質是肉中的關鍵風味物質，ROAV越大，代表該物質對整體的風味貢獻度越大，而0.1≤ROAV＜1的物質對整體風味也有比較重要的輔助作用。

由表3可知，宰后羊肉不同成熟時間的風味存在一定差異，但關鍵揮發性風味物質的組成相互交叉，共有的關鍵揮發性風味物有己醛、庚醛、壬醛和1-庚醇。這幾種物質在羅玉龍等的研究中也被確定為關鍵風味物質。醛類物質主要來源于脂肪的氧化和降解，其閾值較小，因此對羊肉的風味形成有重要的作用。本實驗中檢測到的宰后48 h的醛類物質種類最多（圖5）；關鍵風味物質中醛類的含量也最多，這與王柏輝等的研究結果相同，可能是p-AMPK激活了丙二酰單酰輔酶A脫羧酶，導致丙二酰單酰輔酶A含量的降低，加速脂肪酸氧化而造成的。宰后成熟過程中戊醛、庚醛、苯甲醛和壬醛的相對含量均顯著低于宰后0 h（＜0.05），可能的原因是隨著成熟時間的延長，p-AMPK的含量和活力整體呈逐漸下降趨勢，對于脂肪酸氧化和甘油三酯分解的促進作用降低，同時醛類物質被進一步被氧化成酸和其他物質，導致含量下降。壬醛是由油酸氧化所形成的，可賦予羊肉油脂香、花香和橙香，在羊肉宰后成熟過程中的相對含量較高，且閾值相對較小，對羊肉的整體風味貢獻最大（ROAV＝100）。在徐薇薇等對寧夏灘羊的研究中，壬醛也是貢獻最大的風味物質。庚醛的ROAV在宰后48 h最大，其賦予羊肉奶酪味、油脂香、花香和橙香；己醛具有鮮草味，其含量會直接影響肉類的風味，成熟96 h時，己醛的含量顯著高于0 h（＜0.05）。有研究表明宰后成熟過程中己醛含量的增加可能會引起羊肉風味劣變。醇類物質是脂肪降解的另一種產物，其中1-庚醇對風味的貢獻度在宰后48 h最大，賦予了羊肉油脂香、酒香；1-辛烯-3-醇是脂肪氧化酶作用于花生四烯酸而形成的，具有蘑菇味和發酵味，對于羊肉揮發性氣味有重要影響。1-辛烯-3-醇在宰后0 h并未被檢測出，48 h時相對含量達到最大值，隨后又顯著下降（＜0.05）。整體上，宰后成熟時間對羊肉揮發性風味物質的形成具有較大影響，隨著成熟時間的延長，風味物質的豐富度有所提高，關鍵風味也發生了變化。

表3 蘇尼特羊宰后成熟過程中關鍵揮發性風味物質及相應ROAVTable 3 Relative odor activity value (ROAV) of critical volatile flavor substances during post-mortem aging of Sunit lamb meat

3 結 論

在宰后成熟過程中，蘇尼特羊肉中p-AMPK的質量濃度和活性都呈現先上升后下降的趨勢，并在宰后成熟24 h達到最高；糖酵解指標中，pH值在宰后成熟0～24 h內顯著下降（＜0.05），24～96 h趨于穩定；肌糖原和游離葡萄糖含量呈現逐漸下降的趨勢，宰后成熟48 h后趨于穩定；乳酸含量在成熟24 h到達最高點，48 h后逐漸趨于平緩。在肉品質指標中羊肉的剪切力在宰后成熟24 h達到最大值，隨后下降，48 h后趨于穩定；*值在宰后成熟96 h最大，*值及*值在宰后均呈現先升高后平緩的趨勢；宰后成熟過程中揮發性風味物質種類整體呈現升高的趨勢，其中48 h的醛類物質種類最多、含量最高，可能有助于提高羊肉的整體風味；共有的關鍵揮發性風味物質包括己醛、庚醛、壬醛和1-庚醇。總體上，宰后不同時間點AMPK含量和活性的變化會造成糖酵解指標的改變，進而影響肉品質指標的變化，同時AMPK含量和活性的改變會影響宰后成熟過程中部分揮發性風味物質的含量與ROAV；蘇尼特羊被屠宰48 h后，肌肉中的pH值、糖原和乳酸的含量趨于穩定，嫩度開始改善，風味物質種類增多，這表明成熟48 h后羊肉具有較好的品質和風味，適宜加工食用。