Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)展

劉暢 趙宏 路子鑫

摘要：本文就對(duì)Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究進(jìn)行深入的分析。當(dāng)前，Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基在狂犬病疫苗等病毒性疫苗的研發(fā)中有著廣泛的應(yīng)用并獲得普遍認(rèn)可，但其在疫苗商業(yè)化生產(chǎn)的實(shí)際應(yīng)用還存在諸多欠缺，如生產(chǎn)工藝需要完善和優(yōu)化、生產(chǎn)質(zhì)量與生產(chǎn)效率有待進(jìn)一步提高、無(wú)血清培養(yǎng)基組分秘而不宣、無(wú)血清培養(yǎng)基發(fā)展的在線交流平臺(tái)和數(shù)據(jù)庫(kù)有待完善等。

關(guān)鍵詞：Vero細(xì)胞;無(wú)血清培養(yǎng)基;研究進(jìn)展

【中圖分類(lèi)號(hào)】 R457.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A? ? ? 【文章編號(hào)】2107-2306（2022）13--01

1 Vero細(xì)胞無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基的發(fā)展

1.1 Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)及應(yīng)用

Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)技術(shù)與含血清培養(yǎng)技術(shù)的區(qū)別主要在于培養(yǎng)基，而其他培養(yǎng)工藝基本沒(méi)有差異。Vero細(xì)胞具有貼附依賴(lài)生長(zhǎng)的特性，在體外培養(yǎng)需要合適的基質(zhì)表面供其貼附鋪展生長(zhǎng)。在規(guī)模放大工藝中使用的貼附基質(zhì)是微載體，常用的有cytodex1和cytodex3。用cytodex1和FibraCelDisks（聚酯纖維盤(pán)片載體）微載體，在VP-SFM培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞和狂犬病毒。

1.2 Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基的研究

1.2.1生長(zhǎng)激素和生長(zhǎng)因子

激素是無(wú)血清培養(yǎng)基的必需組分，如胰島素，主要作用是增加細(xì)胞內(nèi)的camp水平，促進(jìn)葡萄糖、氨基酸利用。除此以外，Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基還需添加糖皮質(zhì)激素、甲狀腺激素、胰高血糖素等激素。生長(zhǎng)因子主要促進(jìn)細(xì)胞的有絲分裂，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)因子都是通過(guò)牛血清引入的。Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基添加的生長(zhǎng)因子有表皮生長(zhǎng)因子、β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子和血小板生長(zhǎng)因子。在研發(fā)Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基時(shí)添加了100μg/L的表皮生長(zhǎng)因子，使Vero細(xì)胞的密度提高了15%。除了人為添加外，細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中也會(huì)釋放一些生長(zhǎng)因子促進(jìn)自身的分裂。

1.2.2蛋白質(zhì)類(lèi)

在實(shí)驗(yàn)研究中最常用的是牛血清白蛋白和轉(zhuǎn)鐵蛋白，白蛋白是低相對(duì)分子質(zhì)量組分的載體。白蛋白主要是調(diào)節(jié)滲透壓和保護(hù)細(xì)胞免受物理?yè)p傷，與維生素、脂類(lèi)、激素、金屬離子和生長(zhǎng)因子結(jié)合，穩(wěn)定和調(diào)節(jié)其在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的活性。目前，無(wú)血清培養(yǎng)基的開(kāi)發(fā)研究主要添加的是重組蛋白和植物水解蛋白。

1.2.3促貼壁因子

Vero細(xì)胞是貼附依賴(lài)性細(xì)胞系，無(wú)血清培養(yǎng)基中必須添加促細(xì)胞貼壁的物質(zhì)，使Vero細(xì)胞在培養(yǎng)基質(zhì)表面貼壁鋪展生長(zhǎng)。應(yīng)用較廣泛的是纖粘連蛋白、膠原蛋白、層粘連蛋白、多聚-L（或-D）賴(lài)氨酸和鳥(niǎo)氨酸。

2 Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)的應(yīng)用

2.1 Vero細(xì)胞為基質(zhì)的疫苗

2.1.1流感病毒疫苗

已經(jīng)獲得許可并應(yīng)用多年的流感疫苗全部是用雞胚培養(yǎng)生產(chǎn)。雞胚培養(yǎng)存在成本高、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、易污染的缺點(diǎn)。研究說(shuō)明A型和B型流感病毒在Vero細(xì)胞良好適應(yīng)和增殖。Vero細(xì)胞在生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)的使用，避免了雞胚培養(yǎng)的缺點(diǎn)。Vero細(xì)胞為基質(zhì)的流感疫苗預(yù)防新型流感的暴發(fā)流行是可行的。

2.1.2腸道病毒71型疫苗

腸道病毒71型（EV71）病原體是引起人類(lèi)手足口病的主要病原體。近年來(lái)，針對(duì)EV71的感染，在臨床還沒(méi)有有效的抗病毒藥物進(jìn)行治療。因此，需要接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。當(dāng)前，EV71的疫苗研究主要有核酸疫苗和亞單位疫苗。Vero細(xì)胞生產(chǎn)的EV71型病毒滅活疫苗免疫小鼠后，比對(duì)于核酸疫苗和亞單位疫苗的免疫應(yīng)答強(qiáng)。目前，已有廠家研制的滅活Vero細(xì)胞EV71疫苗完成了Ⅲ期臨床研究。

2.1.3輪狀病毒疫苗

輪狀病毒外殼的VP7蛋白（G型）和VP4蛋白（P型）能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，這兩種抗原蛋白也是中和抗體的作用靶目標(biāo)。因此，該五價(jià)疫苗可預(yù)防多種血清型輪狀病毒的感染。

2.2 Vero細(xì)胞的來(lái)源

近年來(lái)隨著生物技術(shù)的發(fā)展，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)已從簡(jiǎn)單的試驗(yàn)研究拓展到了生物學(xué)研究和商業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域。生物制品如生物基因工程疫苗、病毒性疫苗、醫(yī)學(xué)治療性抗體的研究與生產(chǎn)都用到了細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)。應(yīng)用最廣泛最安全的動(dòng)物細(xì)胞基質(zhì)是Vero細(xì)胞。Vero細(xì)胞是世界衛(wèi)生組織（WHO）和《中國(guó)藥典》認(rèn)可的疫苗生產(chǎn)細(xì)胞系。Vero細(xì)胞在疫苗的生產(chǎn)從輪狀活病毒疫苗到流感減毒活疫苗，再到滅活全病毒疫苗的發(fā)展都證明Vero細(xì)胞在一系列病毒性疫苗發(fā)展中具有重要的價(jià)值。

2.3 Vero細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)

Vero細(xì)胞系廣泛應(yīng)用于人用疫苗的生產(chǎn)是基于其獨(dú)特的特性。Vero細(xì)胞因其固有的基因缺陷，不能表達(dá)抗病毒蛋白干擾素。試圖用新城疫病毒、仙臺(tái)病毒、風(fēng)疹病毒感染Vero細(xì)胞生產(chǎn)干擾素，結(jié)果表明Vero細(xì)胞不能表達(dá)分泌干擾素蛋白。然而，在相同條件下，改用BSC-1細(xì)胞和其他靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞重復(fù)這一實(shí)驗(yàn)時(shí)，這些細(xì)胞系可以表達(dá)分泌大量干擾素蛋白。Vero細(xì)胞可能存在β和α基因的缺陷，不能表達(dá)干擾素蛋白。Vero細(xì)胞的廣泛易感特性促進(jìn)了使用Vero細(xì)胞生產(chǎn)疫苗事業(yè)的發(fā)展。除了以上優(yōu)勢(shì)，與生產(chǎn)生物制品生產(chǎn)用原代細(xì)胞系和二倍體細(xì)胞系相比，Vero細(xì)胞還具有以下優(yōu)勢(shì)：第一，來(lái)源方便，容易建立細(xì)胞庫(kù)和保存，可連續(xù)傳代，生長(zhǎng)速度快;第二，Vero細(xì)胞遺傳性狀穩(wěn)定，惡性化概率小，無(wú)外源性污染，具有良好的生物安全特性;第三，Vero細(xì)胞對(duì)多種病毒敏感，生產(chǎn)的病毒滴度高;第四，Vero細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)條件要求不高，在微載體表面能良好的貼附生長(zhǎng)，易在生物反應(yīng)器放大培養(yǎng)。

3 結(jié)語(yǔ)

如何降低生產(chǎn)成本，是Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基今后的一個(gè)重要研究方向。此外，由于生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)以及發(fā)酵罐懸浮培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)Vero細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)，增加細(xì)胞的濃度，提高病毒的產(chǎn)量，所以適應(yīng)這兩種培養(yǎng)技術(shù)的無(wú)血清培養(yǎng)基是今后一段時(shí)期細(xì)胞工程產(chǎn)品生產(chǎn)和研制的重要發(fā)展目標(biāo)，并且在病毒疫苗的生產(chǎn)上有了一定的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]蘇曉蕊，岳華，湯承.Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，33（2）：87-90.

[2]蘇曉蕊，岳華，湯承.Vero細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，33（2）：87—90.