下調DNA 損傷激活的長鏈非編碼RNA 抗心房顫動大鼠心肌纖維化的機制研究

楊淑玲，谷云飛，楊定憲，高愛玲，尚偉，陳瀅伊，張光

心房顫動（房顫）是常見的室上性心律失常，發生率較高，嚴重時可導致心力衰竭[1-2]。其病因復雜，與心房肌電重構、結構重塑和自主神經失調有關；其中心肌纖維化導致的結構重塑是房顫重要的病理生理因素[3]。心房炎癥與心肌纖維化密切相關[4-5]。

絲裂原激活的蛋白激酶（MAPK）通路的激活在心房纖維化中起著核心作用[6]，p38 絲裂原激活的蛋白激酶（p38 MAPK）/核因子κB（NF-κB）通路是體內重要的炎癥通路，與房顫和不良的心房纖維化有關[7]。

據報道，長鏈非編碼RNA（lncRNA）在結構重塑和肌電重構中起著重要作用，如lncRNA H19[8]和lncRNA MIAT[9]與心臟纖維化相關。有報道稱，DNA損傷激活的長鏈非編碼RNA（lncRNA NORAD）在急性心肌梗死中上調，可促進心肌纖維化和細胞凋亡，敲低其表達可減少梗死面積和纖維化改善病情[10]；還可抑制高糖誘導的人腎小球系膜細胞纖維化和心肌細胞凋亡[11-12]。然而，lncRNA NORAD 在房顫誘導的心肌纖維化中的作用仍未明確。因此，本研究旨在探究lncRNA NORAD 對房顫大鼠心肌纖維化的影響及潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雄性SD 大鼠48 只，體質量200～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司。

將大鼠飼養在12 h 光照間隔12 h 黑暗、溫度（23±2）℃、相對濕度45%～60%的房間中，自由飲食和攝水。

1.2 藥品、試劑及儀器

乙酰膽堿（ACh）、氯化鈣（CaCl2）（Sigma-Aldrich 公司，美國）；重組腺相關病毒血清型9（rAAV9）載體含用于沉默DNA 損傷激活的長鏈非編碼RNA 的小干擾RNA（rAAV9-siNORAD）基因及其陰性對照（rAAV9-NC）、實時熒光定量PCR引物（GenePharm 公司，中國）；p38 MAPK 抑制劑SB203580（Med Chem Express 公司，美國）；RIPA裂解液、BCA 試劑盒（碧云天生物科技公司，中國）；Masson 三色染色試劑盒（Solarbio 公司，中國）；總RNA 提取試劑盒（天根生化科技有限公司，中國）；雙鏈DNA 染料試劑（SYBR Green）（上海聯邁生物工程有限公司，中國）；肌酸激酶同工酶（CKMB）、心肌肌鈣蛋白I（cTnI）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-6（IL-6）ELISA 檢測試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司，中國）；兔源一抗絲裂原活化蛋白激酶激酶6（MKK6）、p38MAPK、磷酸化p38MAPK（p-p38MAPK）、NF-κB p65、磷酸化NF-κB p65（p-NF-κB p65）、β-肌動蛋白（β-actin）及二抗辣根過氧化酶（HRP）標記的山羊抗兔IgG（Abcam 公司，英國）。

NanoDrop 2 000 分光光度計（Thermo Scientific公司，美國）；ABI 7 500 實時熒光定量PCR 儀系統（美國應用生物系統公司）；動物心電圖系統（Nasiff Associates 公司，美國）；iMark680 多功能酶標儀、蛋白轉膜裝置（Bio-Rad 公司，美國）；BX61 電動顯微鏡（Olympus 公司，日本）。

1.3 方法

分組及建模：rAAV9-siNORAD 及其陰性對照（rAAV9-NC）用于實驗干預。SD 大鼠隨機分為對照組、房顫組、rAAV9-NC 組、rAAV9-siNORAD 組、SB203580 組 和rAAV9-siNORAD+SB203580 組，每組8 只。除對照組外，各組大鼠每天經尾靜脈以1 ml/kg 的劑量注射ACh-CaCl2混合液（60 μg/ml ACh和10 mg/ml CaCl2），共7 d，誘導建立房顫模型[13]。于實驗前、建模后觀察并記錄大鼠的心電圖，若房顫大鼠出現P 波消失，代替為小f 波，頻率在350～600 次/min 的典型房顫心電圖，說明大鼠房顫模型制備成功[13]。

建模后，rAAV9-NC 組 和rAAV9-siNORAD組大鼠尾靜脈分別注射rAAV9-NC 和rAAV9-siNORAD（2×1011個載體基因組顆粒/每只大鼠）；SB203580 組大鼠給予1 mg/kg 的SB203580 尾靜脈注射；rAAV9-siNORAD+SB203580 組大鼠經尾靜脈注射1 mg/kg 的SB203580 和rAAV9-siNORAD，1 次/d，連續14 d。

心電圖記錄與分析：實驗前和建模后，戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射使大鼠麻醉。將12 導聯心電圖的四肢導聯插入動物的四肢中，連接心電圖儀（紙速50 mm/s，電壓10 mm/mV），記錄各組大鼠心電圖變化，記錄并排除非竇性心律。實驗第22 d，再次對大鼠進行心電圖測試，記錄房顫的發生率和持續時間。

檢測血清心肌酶和炎性因子水平：心電圖檢測完成后，腹主動脈取血，靜置后以1 617 g 離心15 min，分離血清，按照ELISA 檢測試劑盒說明書的操作檢測CK-MB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平[14]。具體操作為：將50 μl 的大鼠血清加入包被的96 孔板的每個孔中，然后在37℃下孵育60 min。反應結束后，用洗滌緩沖液洗滌孔3 次，然后在每個孔中加入HRP 標記的抗體，37℃孵育30 min。棄去孔內液體，用洗滌緩沖液洗滌孔3 次，再向每孔加入底物A、B 各50 μl，混勻后37℃避光溫育10 min。最后加入終止緩沖液，在450 nm 波長處測量光密度（OD），根據標準曲線，計算CK-MB、cTnI、TNF-α 和IL-6 水平。

Masson 染色檢測心房組織纖維化：取大鼠心臟，用磷酸鹽緩沖液（PBS）（主要成分為Na2HPO4、KH2PO4、NaCl 和KCl，pH 7.4）洗滌血液。分離左心房組織，并分為三部分，兩部分于-80℃冰箱保存，分別用于實時熒光定量PCR 和蛋白免疫印跡（Western blot）實驗；最后一部分用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，進行Masson 三色染色，在光學顯微鏡下觀察膠原蛋白沉積，計算心房膠原容積分數（CVF）[15]。膠原纖維染成藍色。每個樣品選擇三個視野，用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析結果。CVF（%）=心肌膠原纖維面積/所測視野面積×100%。

實時熒光定量PCR 檢測心房組織lncRNA NORAD、Ⅰ型膠原（COL1-A1）和Ⅲ型膠原（COL3-A1）mRNA 表達：取-80 ℃冰箱保存的部分左心房組織。用總RNA 提取試劑盒提取總RNA。使用分光光度計對總RNA 進行定量檢測。按照試劑盒說明書進行逆轉錄。收集cDNA 用于實時熒光定量PCR 擴增[16]。反應體系（20 μl）：cDNA（200 ng/μl）2 μl，SYBR?Premix Ex TaqTM（2×）10 μl，上下游引物（引物序列見表1）各0.4 μl，ddH2O 7.2 μl。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，60℃退火60 s，72℃延伸60 s，進行40個循環。使用2-ΔΔCT方法以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參對照計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列及產物長度

Western blot 檢測心房組織p38 MAPK/NF-κB通路相關蛋白表達：剩余左心房組織在RIPA 裂解液中裂解，4℃，12 000 g 離心15 min。收集上清液，BCA 法測定蛋白質濃度。取等量蛋白樣品通過SDS-PAGE 電泳分離，并轉移到PVDF 膜上。然后，將膜封閉并與一抗（MKK6、p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin，1：1 000）在4℃下孵育過夜。次日將膜用含Tween-20的TBST 緩沖液（主要成分為50 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、0.05% Tween-20，pH 8.0）洗滌3 次，每次10 min，然后在室溫下與HRP 標記的羊抗兔IgG 二抗（1：4 000）在黑暗中孵育1 h。最后，增強化學發光法（ECL）顯色，凝膠成像儀觀察蛋白條帶并拍照，分析結果，β-actin 為內參對照。

1.4 統計學方法

數據使用GraphPad Prism 8.0 軟件進行統計分析，計量資料以均值±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行LSD-t檢驗；計數資料以例（%）表示，差異比較行卡方檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠房顫的發生率和持續時間的比較

心電圖結果顯示，實驗前各組大鼠的心律正常；建模后，對照組大鼠可觀察到規則的P 波，心律正常；房顫大鼠可觀察到P 波消失，出現大小不等、不規則的f 波，R-R 間期變化不規則，提示成功建立了房顫模型（圖1）。實驗結束后，與房顫組相比，rAAV9-siNORAD 組和SB203580 組大鼠房顫的發生率均降低，且持續時間均明顯縮短（P均＜0.05）；與rAAV9-siNORAD 組 和SB203580 組相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 組大鼠房顫的發生率均降低，持續時間明顯縮短（P均＜0.05，表2）。

圖1 正常大鼠及心房顫動大鼠心電圖

表2 實驗結束后各組大鼠房顫發生率和持續時間比較（）

表2 實驗結束后各組大鼠房顫發生率和持續時間比較（）

注：房顫：心房顫動；rAAV9-NC：重組腺相關病毒血清型9 陰性對照；rAAV9-siNORAD：重組腺相關病毒血清型9 載體含用于沉默DNA 損傷激活的長鏈非編碼RNA 的小干擾RNA；SB203580：p38 絲裂原激活的蛋白激酶抑制劑。與對照組比 *P＜0.05；與房顫組比△P＜0.05；與rAAV9-siNORAD 組比 ▲P＜0.05；與SB203580 組比 #P＜0.05

2.2 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、炎性因子水平的比較（表3）

表3 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、炎性因子水平比較（）

表3 各組大鼠血清CK-MB、cTnI、炎性因子水平比較（）

注：房顫：心房顫動；rAAV9-NC：重組腺相關病毒血清型9 陰性對照；rAAV9-siNORAD：重組腺相關病毒血清型9 載體含用于沉默DNA 損傷激活的長鏈非編碼RNA 的小干擾RNA；SB203580：p38 絲裂原激活的蛋白激酶抑制劑：cTnI：心肌肌鈣蛋白I；CK-MB：肌酸激酶同工酶；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細胞介素-6。與對照組比*P＜0.05；與房顫組比△P＜0.05；與rAAV9-siNORAD 組比較 ▲P＜0.05；與SB203580 組比較#P＜0.05

與對照組相比，房顫組大鼠血清CK-MB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平均明顯升高（P均＜0.05）；與房顫組相比，rAAV9-siNORAD 組和SB203580 組大鼠血清CK-MB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平均明顯降低（P均＜0.05）；與rAAV9-siNORAD 組和SB203580 組相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 組大鼠血清CKMB、cTnI、TNF-α、IL-6 水平均明顯降低（P均＜0.05）。

2.3 各組大鼠心房組織纖維化比較

Masson 染色結果顯示，房顫組大鼠的心房組織有明顯的纖維化改變，膠原纖維增生，排列紊亂，CVF 較對照組明顯增加[（35.29±5.35）%vs.（1.41±0.23）%，P＜0.05]，房顫組和rAAV9-NC 組CVF[（32.63±4.82）%]及在心臟間質和血管周圍組織的纖維化方面差異均無統計學意義。與房顫組相比，rAAV9-siNORAD 組和SB203580 組大鼠心房組織均可見藍染的膠原纖維減少，CVF 分別為（21.48±2.79）%、（24.15±2.86）%均明顯降低（P均＜0.05）；與rAAV9-siNORAD 組和SB203580 組相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 組大鼠心房組織均可見藍染的膠原纖維最少，CVF[（14.36±2.20）%]明顯降低（P均＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠心房組織Masson 染色（×200）

2.4 各組大鼠心房組織lncRNA NORAD、COL1-A1和COL3-A1 的mRNA 表達比較（表4）

表4 各組大鼠心房組織lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 表達比較（）

表4 各組大鼠心房組織lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 表達比較（）

注：房顫：心房顫動；rAAV9-NC：重組腺相關病毒血清型9 陰性對照；rAAV9-siNORAD：重組腺相關病毒血清型9 載體含用于沉默DNA 損傷激活的長鏈非編碼RNA 的小干擾RNA；SB203580：p38 絲裂原激活的蛋白激酶抑制劑；lncRNA NORAD：DNA 損傷激活的長鏈非編碼RNA；COL1-A1：Ⅰ型膠原；COL3-A1：Ⅲ型膠原。與對照組比*P＜0.05；與房顫組比△P＜0.05；與rAAV9-siNORAD 組比較▲P＜0.05；與SB203580 組比#P＜0.05

與對照組相比，房顫組大鼠心房組織lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 水平明顯升高（P均＜0.05）；與房顫組相比，rAAV9-siNORAD組和SB203580 組大鼠心房組織lncRNA NORAD、COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 水平明顯降低（P均＜0.05）；rAAV9-siNORAD 組 和SB203580 組相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 組大鼠心房組織COL1-A1和COL3-A1 的mRNA 水平明顯降低（P均＜0.05）。

2.5 各組大鼠心房組織p38 MAPK/NF-κB 通路相關蛋白表達比較（圖3）

圖3 各組大鼠心房組織p38 MAPK/NF-κB 通路相關蛋白水平比較

與對照組相比，房顫組大鼠心房組織MKK6 蛋白水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 的比值均明顯升高（P均＜0.05）；與房顫組相比，rAAV9-siNORAD 組和SB203580 組大鼠心房組織MKK6 蛋白水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK和p-NF-κB p65/NF-κB p65 的比值均明顯降低（P均＜0.05）；與rAAV9-siNORAD組和SB203580組相比，rAAV9-siNORAD+SB203580 組大鼠心房組織MKK6蛋白水平、p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 的比值均明顯降低（P均＜0.05）。

3 討論

近年來，研究證實lncRNA 參與房顫的進展，并在心房纖維化中起重要作用，lncRNA NORAD 與心肌細胞損傷和心肌纖維化密切相關[10-12]。尾靜脈注射ACh-CaCl2屬于藥物誘導建模，是目前建立房顫模型常用方法[13,17]，而且有報道稱，ACh-CaCl2建模后大鼠心房出現纖維化改變[13]。因此，本研究采用此方法成功建立了大鼠房顫模型，并在房顫大鼠中觀察到lncRNA NORAD 上調，血清心肌損傷標志物（cTnI、CK-MB）和炎性因子（TNF-α、IL-6）水平升高，纖維化標志物膠原蛋白表達也上調，并且心房纖維化的程度增加。這提示，lncRNA NORAD的升高可能與房顫大鼠心房纖維化程度有關。

腺相關病毒（AAV）可用于在體內基因轉移實驗，且不同血清型對組織器官的嗜性各有不同，其中AAV9 在全身具有更廣泛的表達分布，對心臟具有明顯親和性，已被廣泛使用[18-19]。本研究采用rAAV9-siNORAD 注射到大鼠體內以敲低lncRNA NORAD，結果顯示敲低lncRNA NORAD 可以降低房顫的發生率和持續時間，并降低COL1-A1 和COL3-A1 的mRNA 水平以及血清心肌損傷標志物和炎性因子水平，減輕心房纖維化。提示下調lncRNA NORAD 可減輕房顫大鼠心房纖維化。

炎癥介導的心肌纖維化在房顫發展中起關鍵作用[20]。p38 MAPK 是MAPK 家族控制炎癥反應最重要的成員，參與心臟重塑過程中與肥大和炎癥相關的有害信號通路的激活，并參與心肌成纖維細胞中基質金屬蛋白酶和膠原蛋白的調節[21-22]。在細胞受到刺激后，NF-κB p65 可發生磷酸化，上調IL-6 和TNF-α 水平，加劇心肌梗死后的炎癥反應和心肌纖維化程度[23]。而且在心肌梗死后發生房顫的大鼠模型中，NF-κB p65 和p38 MAPK 的磷酸化水平增加，降低其磷酸化水平可緩解心肌梗死誘導的房顫的發生率和持續時間[7]。MKK6 是一種負責p38 MAPK 磷酸化的重要MAPK 激酶，可在應激刺激后激活p38 MAPK。本研究結果顯示，房顫大鼠心房組織中MKK6 蛋白和p-p38 MAPK/p38 MAPK 和p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值升高；說明房顫中p38 MAPK/NF-κB p65 通路被激活。敲低lncRNA NORAD 后，房顫大鼠心房組織MKK6 蛋白和p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65 比值明顯降低，且與單獨應用p38 MAPK 抑制劑SB203580 作用效果相似；且SB203580 和rAAV9-siNORAD 的聯合應用對p38 MAPK/NF-κB p65 通路和心肌纖維化的抑制作用優于兩者單獨應用。提示，下調lncRNA NORAD 可能通過抑制p38 MAPK/NF-κB p65 通路激活對房顫大鼠發揮抗心肌纖維化作用。

綜上所述，下調lncRNA NORAD 可減輕房顫大鼠心肌纖維化，其作用機制可能與抑制p38 MAPK/NF-κB p65 通路有關。本研究僅從動物水平上進行了初步探究，下一步將從體外細胞水平論證結果，并對右心房病理學變化深入觀察探究。此外，由于NORAD 為非編碼RNA，存在多個靶點，多方面調控的作用，是否能通過其他通路發揮作用，需進一步探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突