鎘脅迫對巴西蘑菇鎘亞細胞分布和非蛋白巰基的影響

周宇，張聰慧，翁伯琦，陳華，劉朋虎

（1. 福建農林大學園藝學院，福州 350002；2. 福建省農業科學院農業生態研究所，福州 350013；3. 福建農林大學國家菌草工程技術研究中心，福州 350002）

巴西蘑菇（）又稱姬松茸、小松口蘑、巴氏蘑菇等，屬于擔子菌門、傘菌綱、傘菌科、蘑菇屬，是一種中溫偏高的腐生菌。由于其具有豐富的營養價值和藥用價值，深受廣大消費者的喜愛。鎘（Cd）具有生物毒性強、遷移速度快、易被菌絲體吸收富集的特點，是食用菌重金屬污染的重要類型之一。相對于其他食用菌，巴西蘑菇對鎘具有更強的富集性，鎘超標時有發生，嚴重影響巴西蘑菇的食用價值和出口創匯。因此，采取措施保障巴西蘑菇綠色安全生產已成為目前研究熱點之一。前人對食用菌鎘耐性和鎘解毒機制開展了較多研究，已在低鎘積累菌株篩選、鎘富集機制、鎘解毒機制、抑制消減雜交技術、轉錄組等方面取得一定成果，對食用菌鎘污染防控提供了借鑒，但目前巴西蘑菇鎘富集機制研究仍不全面。

食用菌對鎘的富集過程主要體現在兩個方面，一是生物吸附作用，即細胞外多聚物和細胞壁上多糖等有機物，通過共價、靜電或分子引力的作用將Cd吸附在菌絲表面；二是主動吸收作用，Cd進入細胞質后與氨基酸、金屬硫蛋白、含巰基小分子等物質結合，形成特殊的鎘螯合物，減輕鎘對細胞的毒害作用。李三暑等通過酶解法和差速離心法對巴西蘑菇細胞進行亞細胞分離試驗，發現細胞壁對鎘具有較強的截留作用，阻礙大部分鎘進入細胞質和液泡內。劉高翔的研究也表明，巴西蘑菇子實體中細胞壁是鎘主要的富集場所，巴西蘑菇還可作為一種新型的生物吸附劑，用以吸附水溶液中Cd。據研究，巴西蘑菇不同菌株對鎘的吸收積累存在很大差異。不同菌株及外源鎘濃度是否影響鎘的亞細胞分布還未見報道。

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）、植物螯合肽（Phytochelatins，PCs）和半胱氨酸（Cysteine，Cys）等小分子化合物，作為植物體內的非蛋白巰基（Non-protein thiols，NPT）化合物能與Cd螯合，形成PC-Cd、GSHCd 和CdS 微晶體等復合物存在于細胞質或運輸到液泡中，從而減緩鎘對植物體的毒害或增強植物對鎘的耐性。此外，與GSH 代謝密切相關的解毒酶——谷胱甘肽硫轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）和谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione Peroxidase，GSHPx）在鎘解毒過程中也發揮了重要作用。GSH 在GST 的催化下可與細胞內的Cd絡合形成復合物，將有毒物質轉移到液泡內，以達到緩解鎘毒害的作用。WANG 等研究發現，鎘脅迫下巴西蘑菇菌絲體的GST 和GSH-Px 與所有其他抗氧化酶一樣，在誘導金屬硫蛋白合成之前起到保護作用，提供對鎘脅迫的第一道防線。然而，目前尚不清楚巴西蘑菇菌絲體鎘的吸收積累是否與小分子巰基化合物有關。

課題組前期以巴西蘑菇主栽品種J1 為出發菌株，采用Co誘變技術獲得鎘富集顯著降低的低鎘菌株J77。本研究利用低鎘菌株J77 及對照菌株J1 作為試驗材料，對不同濃度鎘脅迫下2個菌株菌絲中鎘亞細胞分布，以及鎘螯合相關的小分子非蛋白巰基化合物含量變化進行研究，從細胞水平和相關酶活指標探討不同濃度鎘脅迫下2個菌株的響應差異，以期為巴西蘑菇耐鎘機制提供科學依據，同時為低鎘巴西蘑菇新品種選育奠定一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株為巴西蘑菇J1 和J77，菌株保藏于國家菌草工程技術研究中心菌種保種室。

1.2 培養基

復壯培養基：馬鈴薯230 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂0.5 g、VB10 mg、瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 L，pH值為7。

液體培養基：不加瓊脂，其他同復壯培養基。

固體培養基：同復壯培養基。

1.3 試驗設計

試驗設0、2、4、6、8、10 mg·kg6個梯度處理；將含鎘母液（500 mg·L）配制好備用，按試驗設計將不同濃度鎘溶液加入培養基中。供試藥品為分析純氯化鎘（CdCl·2.5HO）。

1.4 鎘脅迫下巴西蘑菇菌絲培養

固體培養基（平板）培養：將配制好的鎘母液按照試驗設計分別加到固體培養基中，在超凈臺里將J1和J77 菌種接到固體培養基中，利用打孔器打孔接種，每一個平板接1 塊大小均一的菌絲體，各處理組設置3個生物學重復，每個生物學重復5 次，于25 ℃恒溫培養箱中培養10 d備用。

液體培養基（靜置）培養：將配制好的鎘母液，按照試驗設計分別加入規格為250 mL 的錐形瓶中，每瓶液體培養基為100 mL，取一塊復壯好的平板，利用打孔器打孔接種，每一個培養瓶接3 塊大小均一的菌絲體，每個處理設置3個生物學重復，每個生物學重復10 次，于25 ℃恒溫培養箱中靜置培養20 d，滅菌水逐一清洗后，過濾和收集菌絲，用液氮速凍保存于-80 ℃備用。

1.5 分析測定項目

1.5.1 測定菌絲生長速度

利用十字交叉法測定10 d 菌絲生長速度，觀察菌絲形態和長勢，并記錄菌絲長勢和菌絲色澤情況。

1.5.2 菌絲體亞細胞組分分離

每個處理稱取5 g新鮮菌絲體進行亞細胞組分分離，取適量溶壁酶（lywallzyme，購于廣東省微生物研究所）配制成20 g·L酶液。按1∶10（∶）往菌絲體加入酶液，30 ℃、80 r·min酶解3 h。將酶解后的溶液轉入50 mL 離心管中，采用差速離心法進行細胞壁、細胞器和細胞液的分離。首先在4 ℃、1 600 r·min離心15 min，所得沉淀為細胞壁組分（F1），上層液備用；此后在4 ℃、18 000 r·min離心 45 min，上層液為細胞液組分（F3），所得沉淀為細胞器組分（F2）。

1.5.3 菌絲體鎘含量測定

將分離好的細胞組分置于50 mL 小錐形瓶中，加入10 mL HNO-HClO（9∶1）混合溶液，封口膜封口過夜，每個處理重復3 次。第2 天置于石墨烯電熱板上加熱，緩慢升溫至215 ℃繼續消煮。直到錐形瓶中的液體由渾濁變為清澈透明，消煮結束。將消煮好的液體淋洗到10 mL 離心管內保存。用型號為PinAAcle 900T 的火焰原子吸收光譜儀進行鎘含量測定。

1.5.4 理化指標測定

使用雙抗體夾心法測定GST活性、GSH-Px活性、NPT 含量和GSH 含量，試劑盒購于上海通蔚生物科技有限公司。利用差減法計算PCs 的含量，即PCs=NPT-GSH。

1.6 數據分析

試驗數據采用Excel 2019 軟件進行數據處理；采用SPSS 19.0 軟件中Duncan 多重性方法比較分析同一菌株不同處理間的差異性，皮爾遜方法進行相關性分析，數據均為3個重復的平均值±標準偏差；采用Origin 2019軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 鎘脅迫對J1和J77菌絲生長情況的影響

不同濃度的外源鎘脅迫對巴西蘑菇菌絲生長影響如表1所示，隨著鎘濃度的增加，J1和J77菌絲生長均受到抑制，由粗壯稀疏逐漸變為纖細濃密，出現氣生菌絲，且J77 氣生菌絲均多于J1（圖1）。當鎘濃度為8～10 mg·kg時，J77 菌絲生長速度高于 J1。隨外源施加鎘濃度增加，菌絲與培養基的接觸面減小，這可能是菌絲抵御鎘脅迫帶來的毒害所產生的一種應激反應。從菌絲色澤來看，隨外源施加鎘濃度增加，J1 和J77 菌絲均由潔白變為微黃（培養10 d 統計的結果），待鎘脅迫下菌絲長滿培養基表面時，菌絲均由微黃色轉為黑色直至死亡。

圖1 鎘脅迫對J1和J77菌絲生長的影響Figure 1 The effect of Cd stress on the growth of J1 and J77 hyphae

表1 鎘脅迫對J1和J77菌絲生長的影響Table 1 The effect of Cd stress on the growth of J1 and J77 hyphae

2.2 鎘脅迫下J1和J77菌絲體中Cd的亞細胞分布

不同濃度的鎘脅迫下J1 和J77 菌絲體內鎘的亞細胞分布結果如表2 所示。相同鎘脅迫水平下，J1 和J77 亞細胞鎘積累量均表現出細胞壁＞細胞液＞細胞器的規律，細胞壁鎘含量均顯著高于各細胞器和細胞液，大量鎘積累在細胞壁。隨著外源施加鎘濃度的增加，J1 和J77 菌株各細胞器組分中的鎘含量均呈上升趨勢。當外源施加鎘濃度達到10 mg·kg時，J1 細胞壁、細胞器和細胞液鎘含量分別是J77 菌株的2.6、1.7倍和2.2 倍，說明J1 和J77 鎘積累量具有一定的差異性。從各細胞器組分分配率上看（圖2），隨著鎘脅迫濃度增加，2個菌株細胞壁鎘含量占比均表現出先升后降的趨勢；2個菌株細胞器鎘含量占比均表現出下降趨勢，2個菌株對照組均顯著高于各處理組；而2個菌株細胞液中鎘含量占比表現較為穩定，J1 和J77 菌株分別占總量的30%～42% 和29%～36%。此外，從分配率來看亞細胞鎘積累量也表現為細胞壁＞細胞液＞細胞器。因此，我們可以推測細胞壁具有固持Cd的作用，這可能是巴西蘑菇菌絲體抵御鎘毒害的重要機制之一。

圖2 巴西蘑菇J1和J77菌絲中Cd的亞細胞組分分配比例Figure 2 The distribution ratio of Cd subcellular components in the hyphae of A. brasiliensis J1 and J77

表2 巴西蘑菇J1和J77菌絲中鎘的亞細胞分布Table 2 The subcellular distribution of Cd in the hyphae of A. brasiliensis J1 and J77

2.3 鎘脅迫對 J1 和 J77 菌絲體 GST 和 GSH-Px 活性的影響

鎘脅迫對J1 和J77 菌株GST 活性的影響見圖3。隨著外源施加鎘濃度的增加，J1 和J77 菌株GST 活性整體波動不明顯，J77 菌株GST 活性均高于J1 菌株。J77 菌株在 2～10 mg·kg之間 GST 活性整體低于對照組。J77 菌株在鎘0、2、4、6、8、10 mg·kg與J1 對應濃度相比，GST活性分別增加了41.64%、17.73%、31.40%、24.03%、28.30%、23.78%。因此，可以推測出低鎘菌株J77會產生更多GST，以此來抵御鎘毒害。

圖3 鎘脅迫對GST活性的影響Figure 3 The effect of Cd stress on GST activity

圖 4 是 J1 和 J77 菌株 GSH-Px 活性的變化趨勢，J1 菌株隨著外源施加鎘濃度的增加，GSH-Px 活性呈上升趨勢。J77 菌株在 0～10 mg·kg范圍內 GSH-Px活性稍有波動，但總體趨于平穩，在10 mg·kg時GSH-Px活性最大，達262.91 IU·L。在4 mg·kg時，J77菌株GSH-Px活性與J1菌株相比，增加了34.91%。整體而言，J77菌株GSH-Px活性均高于J1菌株。

圖4 鎘脅迫對GSH-Px活性的影響Figure 4 The effect of Cd stress on GSH-Px activity

2.4 鎘脅迫對 J1 和 J77 菌絲體 NPT、GSH 和 PCs 含量的影響

鎘脅迫下J1 和J77 菌株NPT 含量變化見圖5，隨外源施加鎘濃度的提高，J1 和J77 的NPT 含量出現先升后降的趨勢。2 菌株NPT 含量均在鎘濃度為2 mg·kg時達到最大值，與其對照相比，J1 菌株和J77 菌株的NPT含量分別增加了17.27%和44.86%。在鎘濃度高于 2 mg·kg時，J1 菌株和 J77 菌株的 NPT 含量均呈下降趨勢，且J77菌株的NPT含量均高于J1菌株。

圖5 鎘脅迫對NPT含量的影響Figure 5 The effect of Cd stress on NPT content

由圖6 所示，隨著外源施加鎘濃度的增加，J1 和J77 中 GSH 含量降低。J1 菌株在鎘濃度為 4 mg·kg時，GSH 含量最低，對照組GSH 含量相比下降了20.84%；而 J77 菌株在鎘濃度為 2 mg·kg時，GSH 含量最低，與對照組相比下降了11.19%。添加鎘濃度為 0 mg·kg時，菌株 J1 GSH 含量高于J77，這可能是J1 生長狀況優于 J77 的原因；鎘濃度為 2～10 mg·kg時，各處理間J77 GSH 含量始終高于菌株J1，說明J77菌株在鎘脅迫下產生更多GSH以減少鎘毒害。

圖6 鎘脅迫對GSH含量的影響Figure 6 The effect of Cd stress on GSH content

由圖 7 所示 ，J1 和 J77 菌株 PCs 含量的變化 與NPT 含量的變化趨勢一致，均出現先升后降的規律。J1 菌株和 J77 菌株的 NPT 含量在 2 mg·kg時達到最大值，分別為36.05 ng·g和40.51 ng·g，相比于對照組分別提高了1.1 倍和2.6 倍。在2 mg·kg后，巴西蘑菇J1 菌株和J77 菌株的PCs 含量均顯著下降，最后趨于平穩。隨著外源施加鎘濃度的增加，菌株J1 和J77 菌絲體內PCs 含量的增加伴隨著GSH 含量的減少，說明鎘脅迫下會使GSH 與PCs 的生物合成受阻，導致細胞代謝紊亂。

圖7 鎘脅迫對PCs含量的影響Figure 7 The effect of Cd stress on PCs content

2.5 鎘脅迫與小分子巰基含量及代謝酶活的相關性

如表3 所示，對菌株J1 進行相關性分析發現，GST 活性與PCs 含量呈極顯著正相關關系（＜0.01）；NPT 含量與PCs 含量也呈極顯著正相關關系（＜0.01）；鎘脅迫與GSH-Px 活性呈顯著正相關關系（＜0.05）；鎘脅迫與GST 活性呈正相關關系，而與NPT、GSH 和PCs含量之間呈負相關關系，但相關性均不顯著（＞0.05）。對菌株J77 進行相關性分析發現，NPT含量與PCs 含量呈極顯著正相關關系（＜0.01）；鎘脅迫與GSH-Px 活性呈正相關關系；鎘脅迫與GST 活性及NPT、GSH 和PCs 含量之間呈負相關關系，但相關性均不顯著（＞0.05）。

表3 不同指標相關性分析Table 3 Correlation analysis of different indicators

3 討論

巴西蘑菇菌絲對鎘有很強的富集能力，但其作用機制仍不清楚。本研究基于課題組前期對巴西蘑菇富鎘機制的研究，即在不同濃度鎘脅迫下，分別探究了鎘對巴西蘑菇菌絲生長特性、礦物質元素吸收以及幾種重要的抗氧化酶活力的影響，初步揭示了巴西蘑菇鎘富集的作用機制。解析重金屬在細胞不同部位的積累，對深入研究富集機制和金屬耐性機制至關重要。本研究對不同濃度鎘脅迫下J1 和J77 菌絲開展了亞細胞分布研究，有助于確定重金屬鎘對不同細胞部位的富集影響。本研究發現，J1 和J77 中鎘亞細胞積累規律為細胞壁＞細胞液＞細胞器，細胞壁是主要的儲存場所，在2個菌株中所占相對比例約為39%～56%。這與李三暑等以巴西蘑菇為試驗材料進行亞細胞分布試驗結果一致，即鎘主要富集在細胞壁。此外，有研究表明，雙孢蘑菇子實體中細胞質是大多數重金屬的主要貯存部位，雙孢蘑菇子實體中鎘在細胞質占比為44%～93%，在細胞壁中占比為6.1%～47%，而在混合膜組分中最低。本研究表明，不同食用菌菌株之間亞細胞鎘積累具有一定差異性，且細胞壁對鎘的吸附作用可降低鎘對菌絲體的毒害。

不同濃度鎘脅迫時，GST 活性和GSH-Px 活性均表現出菌株J77 高于J1，這可能是造成兩種菌株鎘富集差異顯著的原因之一。李冬琴等發現，隨著鎘脅迫時間的延長，水稻鎘高富集品種欣榮優2045 和鎘低富集品種優I2009 GST 活性均出現先升后降的規律。而在本研究中GST活性受鎘脅迫影響不明顯，但鎘低富集菌株J77 GST 活性始終高于菌株J1，說明鎘脅迫下不同菌株間和不同抗性材料間GST 活性差異較大，從而表現出巴西蘑菇抗氧化能力的強弱。GSH-Px 是抗氧化酶體系中的重要成員，可催化谷胱甘肽（GSH）轉化為氧化型谷胱甘肽（GSSG），將有毒的過氧化物還原成無毒的羥基化合物，同時也可以促進HO的分解，從而保護細胞膜的結構及功能不受損害。張亞茹等利用鎘脅迫大球蓋菇菌絲體，發現隨著外源施加鎘濃度的提高，GSH-Px 活性呈現出先升后降的規律。劉賽等報道茶樹GSH-Px編碼基因對非生物脅迫具有一定的抵抗能力。而在本研究中，GSH-Px 活性在兩個不同抗性的菌株中，表現出較強的波動性。通過比較鎘脅迫下兩個菌株的GST 和GSH-Px 活性發現，同一濃度脅迫下J77 菌株高于J1 菌株，說明不同鎘積累型菌株對鎘脅迫的應答機制存在一定的基因型差異，這可能與兩個品種GST 酶和GSH -Px 酶的組成、表達和功能不同有關。

COLLIN-HANSEN 等通過高效液相色譜-質譜儀首次證實了牛肝菌中含有植物螯合肽物質，研究還發現復雜的PCs 物質與GSH 含量降低有關。PCs 和GSH 均含巰基物質（—SH），會與Cd形成螯合物，減少了細胞質中游離Cd的濃度，這些螯合物在轉運蛋白的作用下轉運到胞外，或將其運輸到液泡中區室化隔離。有研究表明，在鎘和鋅脅迫下，叢枝菌根真菌通過增加總NPT 的產生量來緩解氧化應激。HUANG 等的研究也表明叢枝菌根真菌產生的NPT具有防御鎘的毒害作用。此外，在甘蔗、水稻、棉花等植物上也表現出NPT、GSH 和PCs 能提高植物對鎘的耐受能力，通過氧化應激反應緩解鎘帶來的毒害作用。而在本研究中，NPT、GSH 和PCs 含量均表現一定的規律性，隨著施加鎘濃度的增加，NPT 和PCs 含量在兩個菌株中表現出先升后降的趨勢，GSH含量隨鎘濃度提高均呈現下降趨勢且含量都低于對照，表明鎘脅迫下巴西蘑菇不同鎘抗性品種巰基物質變化不盡相同。

眾多研究表明，鎘螯合與小分子非蛋白巰基化合物含量以及小分子非蛋白巰基化合物代謝酶活性有直接關系。通過對鎘脅迫下細胞內鎘螯合相關的小分子非蛋白巰基化合物含量變化以及小分子非蛋白巰基化合物代謝酶活力變化的相關性分析，研究結果表明，鎘脅迫下菌株J1與GSH-Px 活性呈顯著正相關，菌株 J77 與 GSH-Px 活性呈正相關；菌株 J1 與GST活性呈正相關，菌株J77與GST活性呈負相關，說明在抵御巴西蘑菇鎘毒害中GSH-Px 活性比GST 活性作用明顯。兩種菌株NPT 含量與PCs 含量均呈極顯著正相關，孫偉華研究表明，隨著鎘脅迫濃度的增加，水稻根部PCs 含量隨之提高，說明PCs 在抵抗鎘毒害時發揮重要作用。由于與鎘脅迫接觸最密切的菌絲會以更高的NPT 含量來消耗GSH，產生大量的PCs。因此在菌絲體內對鎘具有更高耐受性可歸因于PCs對鎘的螯合能力增強。可見，在巴西蘑菇的解毒機制中PCs發揮了重要作用。

4 結論

（1）在鎘脅迫下，巴西蘑菇2個菌株鎘富集能力表現出J1 為高富集菌株，J77 為低富集菌株，不同鎘積累菌株間鎘亞細胞分布均表現為細胞壁＞細胞液＞細胞器，說明細胞壁是菌絲體主要儲存鎘的場所。

（2）在鎘脅迫下，通過對菌株J77 和J1 中谷胱甘肽硫轉移酶（GST）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活性以及相關性進行分析，GSH-Px 在菌株J1 中反應更強烈，可能是由于不同菌株間鎘耐性不同導致。

（3）在鎘脅迫下，菌株J77 和J1 中非蛋白巰基（NPT）和植物螯合肽（PCs）含量變化趨勢一致，呈現出“低促高抑”趨勢，相關性分析表明PCs在巴西蘑菇的解毒機制中發揮重要作用。