基于UHPLC-Q-Exactive/MS及多元統計分析識別梔子果實不同部位差異化學成分

李憶紅，梁雨璐，張潔，解嘉琪，劉傳鑫，黃建梅*（1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 102488；2.河南科技大學臨床醫學院，河南科技大學第一附屬醫院內分泌代謝中心 內分泌代謝科，河南省遺傳罕見病醫學重點實驗室，國家代謝性疾病臨床醫學研究中心洛陽分中心，河南 洛陽 471003；3.北京中醫藥大學 中藥品質評價北京市重點實驗室，北京 102488）

梔子為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果實，其味苦，性寒，歸心、肺、三焦經；具有瀉火除煩，清熱利濕，涼血解毒的功效[1]。在我國梔子主產區有江西、浙江、福建、湖南等地[2]，應用廣泛，屬于原衛生部頒布的第一批藥食同源的中藥材。梔子作為傳統的大宗藥材，具有廣泛的藥理活性，如保肝利膽、抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗抑郁、降血糖、神經保護等，另外還有改善血液循環、抗血栓、防治腦出血等保護心血管系統的藥理活性[3-12]。

在信噪比等于0 dB時，利用多載波系統仿真出的信道沖激響應如圖2所示。紅色曲線為理想值，藍色曲線為估計值。可以看出，在信噪比較低的情況下，經過降噪算法處理后的信道沖激響應能夠較好的模擬理想值。

生梔子苦寒，炮制可降低梔子的寒性，《中國藥典》[1]中有生梔子、炒梔子（清炒至黃褐色）、焦梔子（清炒至焦褐色或焦黑色）3種，是對全果進行炮制，另外在《上海炮制規范》《湖南炮制規范》的記載中，炮制梔子無去殼、帶殼的說法，但根據東漢至明清典籍記載，梔子果實的皮仁分用較為常見，目前部分地區中醫用藥仍沿用古時用法，如清《本草備要》記載“內熱用仁，表熱用皮”；《本草綱目》記載，梔子用以“治上焦、中焦連殼用，下焦去殼”[13-14]；根據記載，樟幫法[15]炮制梔子是去皮留仁，建昌幫法[16]炮制梔子是以皮、仁分用。梔子果皮、果仁易分離，其皮、仁分用可能是臨床使用中兩者表現出了藥效差異，而這種差異可能來源于梔子果皮、果仁的物質基礎的不同。

有研究表明梔子苷、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ在梔子仁中含量比梔子皮中含量高[17]，去乙酰車葉草酸甲酯、京尼平龍膽二糖苷、梔子苷等化合物的含量分布存在差異[18-20]。雖已有文獻報道關于梔子果皮、果仁成分差異研究，但選用的指標成分較少，也缺乏系統性。基于此，本試驗利用UHPLCQ-Exactive/MS技術對梔子果實不同部位的化學成分進行系統性的快速識別，并結合正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）判別模式對梔子果實不同部位特征性差異化合物進行篩選識別，為梔子果皮、果仁藥效差異提供理論依據，也為梔子皮、仁的快速鑒定與臨床合理應用提供了基礎。

1 儀器與材料

超高效液相色譜與質譜聯用儀（Thermo Scientific Q Exactive LC-MS，美國Thermo Fisher公司）；ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）（美國Waters公司）；JA2003B電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；KQ-300DB數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）循環水式多用真空泵（河南省予華儀器有限公司）；TGL-16aR高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；MX-S渦旋混勻儀（北京博雅創新科技發展有限公司）。

質譜級乙腈、乙酸[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；屈臣氏蒸餾水（廣州屈臣氏食品飲料有限公司）；梔子藥材采摘于福建，經北京中醫藥大學楊瑤珺教授鑒定為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoidesEllis）的干燥成熟果實。

采用ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱；以0.2%乙酸水（A）-乙腈（B）作為流動相，線性洗脫梯度（0～1 min，10%B；1～4 min，10%～15%B；4～18 min，15%～30%B；18～24 min，30%～50%B；24～28 min，50%～100%B；28～31 min，100%B；31～32 min，100%～10%B；32～35 min，10%B）；柱溫為30℃；流速為0.3 mL·min-1；進樣量為2 μL。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

通過保留時間、質譜裂解規律、文獻信息共鑒定了22個差異具有統計學意義的化合物[21-25，27-34，42]，如表2所示，化合物1～7、11、12、14～19、21、22等17種化合物在梔子果皮中的含量更高；而化合物8[雞矢藤次苷甲酯（scandoside methyl ester）]、9[梔子苷（geniposide）]、10[京尼平龍膽二糖苷（genipin 1-gentiobioside）]、13（Jasminodiol）、20[順/反西紅花苷Ⅰ（trans-crocin Ⅰ/cis-crocin Ⅰ）]在梔子果仁中的含量更高。

2.2 色譜條件

1）首先根據王家會站1992—2016年最大流量，計算頻率并繪制頻率曲線，取頻率p為10%所對應的流量10.0 m3/s為高水流量。

蘇東坡在《水調歌頭》中有“不應有恨，何事長向別時圓”的句子。蘇軾責怪月亮：你為什么偏偏要在我和家人離別的時候又大又圓呢？月亮時圓時缺是自然現象，亙古不變，這種責備實在奇怪，毫無道理，但是，離別過的人卻對此句深有感觸，它正表達出了詞人懷念弟弟之情深，是為“無理有情”，是為“反常合道”。

將Thermo儀器產生的“.raw”格式的數據，通過Abf（Analysis Base File）Converter、MSFileReader軟件轉換成“.abf”格式的數據，然后利用MSDIAL 4.48軟件進行參數設置（誤差范圍、保留時間范圍、加合物類型等），進行峰提取、對齊操作，然后將歸一化之后的數據集導出，利用軟件SIMCA 14.1進行多元統計分析、主成分分析（PCA）和OPLS-DA。再利用IBM SPSS Statistics 20.0軟件對梔子果皮、果仁兩組間的數據進行正態性檢驗（Kolmogorov-Smirnov）和基于均值的方差齊性檢驗（α＝0.05），然后根據正態性檢驗和方差齊性檢驗的結果進行獨立樣本t檢驗（正態檢驗P＞0.05）或獨立樣本Mann-Whitney U檢驗（正態檢驗P＜0.05），篩選出差異具有統計學意義的化合物。

2.3 質譜條件

采用電噴霧離子源（ESI），在負離子模式下（ESI-）對梔子果實不同部位的樣品進行分析，掃描范圍設定為m/z100～1500 Da。具體的質譜條件參數：毛細管電壓3200 V；毛細管溫度為350℃，離子源溫度為350℃；采用高純N2作為鞘氣和輔助氣，鞘氣流速為35 L·h-1，輔助氣流速為15 L·h-1；采用Thermo Xcalibur 3.0工作站處理數據。

2.4 數據轉換與分析

2.藝術范疇的毛筆書法作品。關于毛筆書法作品與藝術之間的關系是不用贅言的。古今名人字畫皆是書畫愛好者的賞析和收藏的寵兒，也是研究和發展東方藝術的不竭源泉。所謂藝術，即是人類在漫長的生產活動和社會活動中形成和創造的成果，是人們為了滿足自身的需求，以一定的物質載體為中介，以豐富的情感來表現社會生活和審美情趣的審美形態。美術作品即是藝術的一種表現形式。而美術作品，是指繪畫、書法、雕塑等以線條、色彩或者其他方式構成的平面或者立體的造型藝術作品。毛筆書法作為書法門類中一種獨特的表現形式，當然屬于美術作品。因此，從藝術范疇的角度來看，毛筆書法作品應該受到著作權法的保護是毋庸置疑的。

3 結果

3.1 UHPLC-Q-Exactive/MS分析

4.1.4 有機酸類 綠原酸易先脫去咖啡酰殘基，產生碎片離子m/z191.06[M-caffeoyl-H]-及咖啡酸特征離子m/z179.03 [M-quinate-H]-，然后脫去一分子H2O產生m/z173.04 [M-caffeoyl-H2O-H]-，同時咖啡酰基碎片m/z179.03脫去一分子CO2得到m/z135.04 [caffeoyl-H-CO2]-碎片離子。化合物5、7、19的保留時間分別為1.32、1.93、9.14 min，準分子離子峰均為m/z353.09 [M-H]-，三者的質譜碎片離子數據相同（m/z191.06、179.03、173.04、135.04），說明這3個化合物互為同分異構體，同分異構體化合物無法通過質譜分辨，只能結合文獻數據、保留時間和離子豐度差異區分，根據文獻報道新綠原酸裂解碎片強度：m/z191＞179＞135；綠原酸裂解碎片強度：m/z191最強，m/z179和m/z135強度相當，較弱；隱綠原酸裂解碎片強度：m/z179＞191＞135[41-45]。化合物7的碎片離子m/z191.06響應最強，m/z179.03、135.04強度較弱，與文獻報道的綠原酸裂解規律相符，推測化合物5為新綠原酸（5-O-caffeoylquinic acid），化合物7為綠原酸（3-O-caffeoylquinic acid），化合物19為隱綠原酸（4-O-caffeoylquinic acid）。異綠原酸A、B、C的結構比綠原酸多一分子的咖啡酰基，具有相似的結構碎片。在負離子模式下檢測到化合物15、17、18準分子離子峰均為m/z515.12 [M-H]-，二級質譜均有脫去一分子咖啡酰殘基的碎片離子m/z353.09 [M-caffeoyl-H]-，通過查閱保留時間及對比文獻，推測化合物15為異綠原酸B（3，4-di-O-caffeoylquinic acid），化合物17為異綠原酸A（3，5-di-O-caffeoylquinic acid），化合物18為異綠原酸C（4，5-di-O-caffeoylquinic acid），化合物18異綠原酸C的裂解途徑如圖6所示。

圖1 ESI-模式下梔子果皮（A）、果仁（B）的基峰色譜圖Fig 1 Base peak ion current of pericarp（A）and seeds（B）of Gardeniae fructus in negative ion mode

3.2 多元統計分析

采集福建同一批次的20顆梔子果皮、果仁的樣本信息，采用多元統計分析尋找差異成分。通過PCA剔除異常值后，利用OPLS-DA篩選梔子果皮、果仁組間貢獻率高的變量。如圖2中A1、B1所示，在PCA模型中可以觀察到一個異常值（P-13、R-9）。在剔除異常值的基礎上，建立了OPLS-DA模型。R2（cum）和Q2（cum）分別表示模型的真實性和預測能力。當R2和Q2都小于1，且兩個參數接近1時，所建立的模型是穩定合理的。在剔除異常值之后圖2 中A2、B2及表1統計分析的參數可以看出，本試驗建立的OPLS-DA模型R2和Q2值都小于1，保證了分析結果的準確性，具體ESI-模式下交叉比較的多元統計分析模型相關參數見表1。為了進一步驗證所建模型的穩定性，采用置換試驗對所建模型進行驗證。假設檢驗在n＝200時進行，結果如圖2C所示。R2和Q2的左點均小于最右點，Q2截距為-0.469。該模型具有較好的可預測性，且無過擬合現象。

表1 梔子果皮、果仁比較的多元統計分析模型相關參數(ESI-) Tab 1 Parameters of multivariate analysis model of pericarp and seeds of Gardeniae fructus (ESI-)

3.3 梔子果皮、果仁差異化合物的識別

4.1.1 環烯醚萜類化合物質譜解析 梔子中含有多種環烯醚萜類成分，這些成分在ESI-模式下，一般檢測到脫氫準分子離子峰[M-H]-，當流動相中含有酸時，環烯醚萜苷還會生成[M＋HCOO]-[35-37]，如化合物1山梔苷的一級質譜圖中可見m/z437.13 [M＋HCOO]-，化合物3梔子新苷可見m/z419.10 [M＋HCOO]-，化合物8雞矢藤次苷甲酯可見m/z449.08 [M＋HCOO]-。

圖2 多元統計分析結果Fig 2 Results of multivariate statistical analysis

取20顆梔子干燥果實（福建同一批次），分離梔子果皮、果仁，分別粉碎，取各粉末（過一號篩）約0.5 g，精確稱定，置于50 mL離心管中，精密加入25 mL去離子水，40℃超聲提取1.5 h（300 W，40 kHz），減壓抽濾，將續濾液以9820 g離心10 min，取400 μL上清液，即得。

表2 梔子果實不同部位差異化合物的鑒定結果 Tab 2 Identification of compounds with statistical difference in different parts of Gardeniae fructus

4 討論

4.1 化學成分質譜裂解分析

將采集到的兩組原始數據導入SIMCA 14.1進行OPLS-DA分析，結果兩組數據出現明顯差異。如圖2中B2所示，梔子果實果皮、果仁樣品顯著分成兩群，結果提示梔子果實不同部位中含有的化學成分存在顯著差異。

在串聯質譜（MS/MS）中，化合物1山梔苷以m/z391.12458 [M-H]-作為準分子離子峰，對其進行MS2分析，碎片離子m/z229.07、211.06是由準分子離子m/z391.12 [M-H]-依次脫去一分子葡萄糖殘基和脫去一分子H2O形成，從而推斷出其裂解途徑[28，38]，如圖3A所示。化合物4去乙酰車葉草苷酸主要脫去H2O、CO2、葡萄糖殘基或葡萄糖。碎片離子m/z345.12、209.04是由準分子離子m/z389 [M-H]-分別脫去一分子CO2和葡萄糖殘基形成；碎片離子m/z209.04失去一分子CO2，形成碎片離子m/z165.05；碎片離子m/z165.05、147.04也有可能由其前體離子（m/z183.07、165.05）失去一分子H2O形成，由此推測出化合物4去乙酰車葉草苷酸可能的裂解途徑[22]如圖3B所示。化合物9梔子苷準分子離子m/z387.16 [M-H]-，二級掃描中負離子模式可見失去葡萄糖殘基的碎片m/z225.08，說明環烯醚萜類化合物的裂解方式是以糖苷鍵斷裂為主，丟失一分子葡萄糖基和H2O，苷元再次通過逆狄爾斯-阿德爾反應（RDA）方式裂解，生成碎片離子m/z123.04，符合梔子苷的裂解規律[30，40]，如圖3C所示。

圖3 環烯醚萜類化合物的質譜裂解途徑Fig 3 Mass spectra and possible fragment pathways of iridoids

4.1.2 單萜苷類化合物質譜解析 化合物12 jasminoside B、化合物13 jasminodiol是梔子單萜苷類成分，化合物12 Jasminoside B的碎片離子m/z183.10、301.27，是由準分子離子m/z345.15 [M-H]-分別脫去一分子葡萄糖殘基和CO2形成；化合物13 Jasminodiol的準分子離子m/z183.10 [M-H]-脫去一分子CO2產生碎片m/z139.11 [M-H-CO2]-。化合物12的碎片離子m/z183.10 [M-H-C6H10O5]-進一步產生碎片離子m/z165.09 [M-H-C6H10O5-H2O]-、121.10 [M-H-C6H10O5-H2OCO2]-[27]，裂解途徑如圖4所示。

圖4 單萜苷類化合物jasminoside B的質譜裂解途徑Fig 4 Mass spectra and possible fragment pathways of monoterpenoids jasminoside B

4.1.3 二萜類化合物質譜解析 梔子中二萜類化合物主要為色素類成分，其中包括西紅花苷（藏紅花素）及其衍生物，查閱文獻可以發現藏紅花素類成分有很明顯的裂解特征，主要是糖苷鍵的斷裂及脫去CO2分子[21，30，41]，化合物20西紅花苷Ⅰ分子離子峰m/z975.37 [M-H]-首先脫去兩端糖殘基得到碎片離子m/z651.26 [M-gen-H]-、327.16 [M-2gen-H]-，碎片離子進一步脫去CO2分別產生碎片離子m/z283.17 [M-2gen-CO2-H]-、239.18 [M-2gen-2CO2-H]-，化合物21的一級質譜的分子離子峰m/z813.32 [M-H]-與化合物20正好相差一個葡萄糖殘基的相對分子質量（162 Da），推測其為trans-crocin Ⅱ/cis-crocin Ⅱ，即西紅花苷Ⅱ；化合物22的分子離子峰m/z651.27 [M-H]-與化合物20西紅花苷Ⅰ相差一個龍膽二糖殘基的相對分子質量（324 Da），推測其為trans-crocin Ⅲ/cis-crocin Ⅲ，即西紅花苷Ⅲ。化合物20的裂解途徑如圖5所示。

圖5 二萜類化合物西紅花苷Ⅰ的質譜裂解途徑Fig 5 Mass spectra and possible fragment pathways of crocin Ⅰ

取梔子樣品，按“2.2”和“2.3”項下液質條件進行數據采集與分析，梔子不同部位樣品在負離子模式下的基峰離子流色譜圖（BPI）如圖1所示。

結合實際所能得到數據情況，以市州作為決策單元研究某一年的發展情況。選取化肥施用量(X1)、農牧漁業從業人員(X2)、農業機械總動力(X3)、有效灌溉面積(X4)、農業機械總動力(X5)、農業用電量(X6)為投入指標，同時以農牧漁業增加值(Y1)、農民人均純收入(Y2)、糧食產量(Y3)為產出指標來評價市州的農業循環經濟發展情況。

圖6 有機酸類化合物異綠原酸C的質譜裂解途徑Fig 6 Mass spectra and possible fragment pathways of organic acids 4，5-di-O-caffeoylquinic acid

4.2 提取溶劑的選擇

在預試驗中，分別以70%甲醇、水兩種體系作為提取溶劑，按照“2.2”和“2.3”項下液質條件進行考察，結果表明梔子果皮、果仁的醇提物、水提取色譜圖大體相同，其中醇提物的質譜響應稍強，考慮到梔子入藥的使用方法及綠色環保的角度，故選擇水作為提取溶劑。

蔣大偉吹著口哨，驅車行駛在街道上。姑娘叫鄭馨，她的眼睛盯著窗外，額前的頭發被風吹得亂飛。蔣大偉從后視鏡里看看鄭馨，沒話找話地：喂，美女，去蘭江大橋做啥？鄭馨瞥了他一眼，繼續看著窗外。蔣大偉猜測地：是來旅游吧？鄭馨伸手整理了一下頭發，還是一言未發。蔣大偉熱情不減地：蘭江大橋是咱這地界的標志性建筑！旅游不去蘭江大橋等于沒來。蔣大偉瞥了一眼后視鏡，鄭馨瞪大眼睛在看著他，繼續說道：你坐我的車就對了！我保證不出一個鐘頭給你送到大橋頂上！鄭馨從耳朵上取下耳機，皺緊眉頭：你說什么？蔣大偉泄氣地：得，白說了。

4.3 梔子不同部位差異化合物的臨床意義

本研究在ESI-模式下篩選鑒定了22個差異成分，其中雞矢藤次苷甲酯、京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、jasminodiol、西紅花苷Ⅰ在梔子果仁中的含量更高。研究表明梔子苷、西紅花苷都具有抗炎、保肝利膽等作用，并且對神經系統和心腦血管疾病也有治療作用[3-4，46]，鑒于本試驗發現梔子苷及西紅花苷Ⅰ在梔子果皮、果仁中分布存在顯著差異，果仁中梔子苷及西紅花苷Ⅰ分別是果皮中的1.27、1.28倍，可以認為梔子果仁在梔子苷和西紅花苷Ⅰ方面的藥效比梔子果皮的效果更好；綠原酸及其異構體是一類具有抗氧化、抗菌、降血脂、降血壓、降血糖、抗抑郁和焦慮等多方面藥理作用的天然化合物[47]，雖然梔子質控的藥效成分梔子苷在果仁中分布高于果皮，但綠原酸、異綠原酸及其異構體在梔子果皮中分布遠高于果仁，也可以認為在有機酸類化合物藥效方面梔子果皮比果仁效果更好，說明梔子果皮、果仁分用有一定的科學依據。

4.4 局限與不足

本試驗在識別鑒定化合物過程中，缺少對照品進行對比，只能通過質譜二級碎片、保留時間、離子豐度及文獻信息作為參考，推測化合物的歸屬，可能存在一定的假陽性結果；同時，在對比梔子果皮、果仁成分差異時，只得出西紅花苷Ⅰ在梔子果仁中的相對含量更高，而西紅花苷Ⅱ在梔子果皮中的相對含量更高，與文獻研究結果不完全一致[17]，未使用不同產地不同批次的梔子藥材，試驗條件有待進一步優化；其次，本研究鑒定梔子所含有的22種化學成分都是文獻中報道的已知化合物，仍存在部分離子峰沒有確定歸屬，可通過分離純化等手段對含量較低的成分進行富集，鑒別出更多差異化合物；在選擇離子模式時，預試驗圖譜顯示負離子模式信號強度更高，選擇梔子文獻中常用的負離子模式，結果可能具有片面性。

5 小結

本研究應用UHPLC-Q-Exactive/MS技術對梔子果皮、果仁不同部位中化合物進行分析與鑒定，共鑒定出22種差異具有統計學意義的化合物，其中雞矢藤次苷甲酯、京尼平龍膽二糖苷、梔子苷、jasminodiol、西紅花苷 Ⅰ 5種成分在梔子果仁中的相對含量更高，山梔苷、京尼平苷酸、梔子新苷、去乙酰車葉草苷酸甲酯、異羥梔子苷、京尼平、jasminoside B、蘆丁、金絲桃苷/異槲皮苷、西紅花苷Ⅰ、綠原酸、異綠原酸及其異構體等17種成分在梔子果皮中的相對含量更高。該方法的建立為中藥不同部位入藥的的物質基礎的研究提供了一定的參考，也為梔子果皮、果仁分用的科學性及臨床應用的合理性提供一定的研究基礎。