液相色譜-質譜法分析磷酸蘆可替尼中強制降解后的產物

劉發貴，孫麗霞，李敏，劉思光，李鐵健，張貴民（.山東新時代藥業有限公司，山東 臨沂 273400；2.魯南制藥集團股份有限公司，山東 臨沂 276002）

骨髓纖維化實質上是一種骨髓增殖性腫瘤[1]。磷酸蘆可替尼作為一種 JAK抑制劑[2-3]，具有潛在的抗腫瘤和免疫調節活性，用于治療中間或高危骨髓纖維化，包括原發性骨髓纖維化，真性紅細胞增多癥后骨髓纖維化和原發性血小板增多癥后骨髓纖維化的治療[4-5]。磷酸蘆可替尼作為首個骨髓纖維化治療藥物（結構見圖1），也是目前唯一批準針對其發病機制的靶向藥物[6-7]。

圖1 磷酸蘆可替尼化學結構圖Fig 1 Chemical structure of ruxolitinib phosphate

本文主要采用高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質譜聯用技術（LC-MS）研究磷酸蘆可替尼的強制降解產物，了解其穩定性及降解途徑[8-10]，為藥品的質量控制提供依據。

1 材料

1.1 儀器

安捷倫UPLC串聯6540B Q-TOF色譜-液質聯用儀（安捷倫）；高效液相色譜儀Thermo Ultimate 3000，配DAD檢測器（Thermo）；高效液相色譜儀Waters ALLIANCE e2695，配PDA檢測器（Waters）；電子分析天平（XSR105U/A、XPR10）、pH計（S210）（Mettler Toledo）。

1.2 試藥

乙酸銨（Merck，LC-MS專用，50 g，批號：A1468804117）；氫氧化鈉（批號：2009172）、鹽酸（批號：2103151）、30%過氧化氫（批號：190826）（西隴科學，分析級）；乙腈（Merck，色譜級，批號：I1102930036）；磷酸蘆可替尼（佰麥生物，純度：99.9%，批號：BM20210111）。

2 方法

2.1 液相色譜條件

色譜柱：YMC Triart C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）；以水為流動相A，甲醇為流動相B；梯度洗脫（0～5 min，45%B；5～20 min，45%～70%B；20～25 min，70%～75%B；25～26 min，75%～45%B；26～35 min，45%B）；柱溫40℃；流速1.0 mL·min-1；檢測波長230 nm，同時開啟3D數據采集（190～400 nm）；進樣量20 μL。

2.2 色譜-質譜條件[11]

色譜柱：YMC Triart C18（2.1 mm×150 mm，1.9 μm）；以10 mmol·L-1乙酸銨水溶液為流動相A，乙腈為流動相B；梯度洗脫（0～2 min，20%B；2～14.5 min，20%～60%B；14.5～14.6 min，60%～20%B；14.6～20 min，20%B）；柱溫40℃；流速0.3 mL·min-1；檢測波長230 nm；進樣量10 μL。

電噴霧解吸電離源DESI，正離子檢測模式；離子源霧化溫度300℃；毛細管電壓400 V；錐孔電壓45 V；裂解電壓60 V（Fragmentor）；干燥氣流量8 L·min-1；MS掃描范圍50～1600m/z。

2.3 溶液配制

2.3.1 供試品溶液（未破壞溶液） 取本品約2 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，加乙腈-水（20∶80）（以下簡稱溶劑）溶解，并稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液（質量濃度為 0.2 mg·mL-1）。

2.3.2 強制降解試驗 取本品約2 mg，精密稱定，置10 mL量瓶中，高溫破壞24 h（105℃條件下固體直接暴露）；取供試品溶液直接暴露于4500 lx強度光照10 d；氧化破壞（1 mL溶劑溶解后，加10%雙氧水1 mL，80℃水浴）2 h；酸破壞（1 mL溶劑溶解后，加2 mol·L-1鹽酸溶液1 mL，80℃水浴）2 h；堿破壞（1 mL溶劑溶解后，加1 mol·L-1氫氧化鈉溶液1 mL，80℃水浴）5 min。取上述各破壞樣品，加溶劑稀釋至刻度（酸堿破壞需中和至中性），搖勻，濾過，取續濾液，作為各條件下的強制降解溶液。同時做各條件下的空白試驗。

3 結果

3.1 強制降解結果

經過液質聯用的分析，初步鑒定出11個降解雜質，分別命名為雜質A～K，各破壞條件下降解雜質及磷酸蘆可替尼含量見表1及圖2。

圖2 強制降解性試驗HPLC色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of the forced degradation

表1 磷酸蘆可替尼強制降解試驗結果 (%) Tab 1 Ruxolitinib phosphate forced degradation test (%)

3.2 磷酸蘆可替尼及降解產物母離子與特征離子

通過ESI＋-MS對上述破壞溶液進行測定，得到磷酸蘆可替尼降解雜質一級質譜圖的[M＋H]＋及主要特征離子，各降解雜質可能的降解途徑及結構推理簡要如下。

3.2.1 雜質A、雜質B和雜質C

① 對于雜質A、雜質B：ESI＋-MS測得的雜質A的一級質譜圖中m/z325為[M＋H]＋峰，相對分子質量為324，比蘆可替尼多一個水分子。最有可能是-CN官能團被氧化，成為酰胺鍵。ESI＋-MS測得的雜質B的一級質譜圖中m/z326為[M＋H]＋峰，表明其相對分子質量為325，比蘆可替尼多19，即-CN被氧化成-COOH。最有可能是在雜質A的基礎上，-NH2被-OH取代（見圖3）。

② 對于雜質C：ESI＋-MS測得的雜質A的一級質譜圖中m/z186為[M＋H]＋峰，相對分子質量為185，正好是雜質C的一個單元。從蘆可替尼中掉下的另一個五元環單位，紫外響應弱，本法無法有效檢出（見圖3）。

圖3 磷酸蘆可替尼降解產生雜質A、B和C的可能途徑Fig 3 Possible degradation pathways for impurity A， B and C from ruxolitinib phosphate degradation

3.2.2 雜質D、雜質E和雜質F

① 對于雜質D：ESI＋-MS測得的雜質D的一級質譜圖中m/z311為[M＋H]＋峰，相對分子質量為310，比蘆可替尼多4。最有可能是結構中含1個氮的五元環發生光自由基反應，從而開環，分別生成-NH2和-CHO，推測出雜質D的結構（見圖4）。

② 對于雜質E和雜質F：ESI＋-MS測得的雜質E的一級質譜圖中m/z323為[M＋H]＋峰，相對分子質量為322，比蘆可替尼多16。可能是蘆可替尼C14位和C15位形成環氧環，推測出雜質E。ESI＋-MS測得的雜質F的一級質譜圖中m/z341為[M＋H]＋峰，相對分子質量為340，比雜質E多18。即比雜質E的環氧環發生了開環，生成2個-OH，推測出雜質F的結構（見圖4）。

圖4 磷酸蘆可替尼降解產生雜質D、E和F的可能途徑Fig 4 Possible degradation pathway for impurity D，E and F from ruxolitinib phosphate

3.2.3 雜質G、雜質H和雜質I

① 對于雜質G：ESI＋-MS測得的雜質G的一級質譜圖中m/z305為[M＋H]＋峰，表明其相對分子質量為304，比蘆可替尼少2。即最有可能是手性碳原子上形成雙鍵，即6號位和3號位形成雙鍵。推測出雜質G的結構（見圖5）。

圖5 磷酸蘆可替尼降解產生雜質G、H和I的可能途徑Fig 5 Possible degradation pathways for impurity G，H and I from ruxolitinib phosphate

② 對于雜質H和雜質I：ESI＋-MS測得雜質H的一級質譜圖中m/z373為[M＋H]＋峰，相對分子質量為372，比雜質A多48，可能是7、9、17號位等3個位置的氮形成了氮氧鍵，推測出雜質H的結構。同理分析，ESI＋-MS測得雜質I的一級質譜圖中m/z357為[M＋H]＋峰，相對分子質量為356，比雜質A多32。可能9號和17號位置氮形成氮氧鍵，但具體位置，目前的研究無法準確判定，需要進一步試驗進行確認。

3.2.4 雜質J和雜質K ESI＋-MS測得的一級質譜圖中m/z323均為[M＋H]＋峰，相對分子質量均為322，比雜質A少2，可能是手性碳原子位置脫去2個氫形成雙鍵，即3號和6號位置間，6號和16號位置間，具體兩者如何區分，目前研究無法確認，有待進一步試驗確認，本文將3號和6號位置間形成雙鍵的化合物命名為雜質K，另一結構命名為雜質J（見圖6）。

圖6 磷酸蘆可替尼降解產生雜質J和K的可能途徑Fig 6 Possible degradation pathways for impurity J and K from ruxolitinib phosphate

綜上將磷酸蘆可替尼可能的降解途徑歸納見圖7。

圖7 磷酸蘆可替尼可能的降解途徑Fig 7 Possible degradation pathways of ruxolitinib phosphate

4 結論

磷酸蘆可替尼在高溫和光照條件下，較為穩定，但是在酸和堿條件下易降解，氧化條件下極易降解。經過初步鑒定共得到11個降解雜質（見表2及圖8），其結構還存在不確定性，本文提到的結構僅供參考[12-13]。雜質H和雜質I均為氮氧化合物，由于結構中存在較多氮原子，在無對照品的基礎上，很難確定其準確的氮氧鍵的位置，本文列出的結構為理論上最大可能性的結構。同時雜質J和雜質K為同分異構體結構，性質類似，目前的研究無法判定其在本法中的出峰順序，有待進一步試驗證明。

圖8 磷酸蘆可替尼及其主要降解產物的推測結構Fig 8 Proposed chemical structures of ruxolitinib phosphate and its major degradation compounds

表2 磷酸蘆可替尼及其主要降解產物的質譜特征 Tab 2 Mass spectrometry characteristics of ruxolitinib phosphate and its major degradation compounds

綜上所述，本文檢測方法簡便，能夠有效分離各降解雜質，為磷酸蘆可替尼的質量控制提供參考，同時對其降解雜質的研究，也可為其存儲及質量研究提供參考依據。