山豆根藥材UPLC-UV指紋圖譜及3種成分含量測定研究

南俊伶，王超眾，閆廣利*，吳芳芳，宋志軍，王碩，周小雷，繆劍華，王喜軍，*（.黑龍江中醫(yī)藥大學，國家中醫(yī)藥管理局中醫(yī)方證代謝組學研究中心，教育部經(jīng)典名方有效性評價及產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工程研究中心，哈爾濱 50040；.廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，西南瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實驗室，南寧 53003）

山豆根為豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖，又名廣豆根，主要分布于廣西、貴州等地[1]，具有清熱解毒、消腫利咽的功效[2]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，山豆根具有抗腫瘤[3]、抗病毒[4]、鎮(zhèn)痛、抗炎[5]、抗肝損傷[6]、抗氧化[7]以及增強免疫[8]等藥理作用。山豆根中主要含有生物堿類、黃酮類、三萜類成分[9]，《中國藥典》規(guī)定山豆根中含苦參堿和氧化苦參堿的總量不得少于0.70%[2]，除藥典規(guī)定外，也有研究對山豆根中的金雀花堿、槐果堿、槐醇、芒柄花素、越南槐醇以及高麗槐素等成分的含量進行檢測[10-12]，然而仍沒有對山豆根各類成分進行整體分析的質(zhì)量控制方法。本課題利用超高效液相色譜-紫外光譜法對山豆根藥材進行指紋圖譜分析，并同時測定三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素等3個非生物堿活性成分的含量，為山豆根藥材的整體質(zhì)量控制提供有效方法。

1 材料

超高效液相色譜儀（ACQUITY UPLC，美國Waters公司）；光電二極管陣列檢測器（ACQUITY PDA，美國Waters公司）；電子分析天平（AE-240，瑞士梅特勒公司）；數(shù)控超聲波清洗器（KQ-300DA 型，中國昆山市超聲儀器有限公司）；國家藥典委員會中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012年版。

乙腈（色譜純，美國Fisher公司）；磷酸（色譜純，中國科密歐化學試劑公司公司）；甲醇（分析純，天津市富宇精細化工有限公司）；水為超純水。

高麗槐素（批號：RFS-M03002005008）、氧化苦參堿（批號：Y-013-181216）、三葉豆紫檀苷（批號：RFS-S06111812027）（對照品，純度均＞98%，成都瑞芬思生物科技有限公司）；山豆根素對照品（批號：21S059-A2，純度＞95.8%，上海甄準生物科技有限公司）。16批山豆根藥材產(chǎn)地如表1所示，經(jīng)鑒定為豆科植物越南槐Sophora tonkinensisGagnep.的干燥根和根莖。

表1 山豆根藥材產(chǎn)地 Tab 1 Origin of 15 batches of Sophora Tonkinensis

2 指紋圖譜分析方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Acquity UPLC HSS T3柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相：乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫程序如表2；檢測波長203 nm；流速0.3 mL·min-1；柱溫25℃，進樣量1 μL。

表2 梯度洗脫程序 Tab 2 Elution gradient

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別取三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素、氧化苦參堿的對照品適量，精密稱定，配制成質(zhì)量濃度分別為0.9810、0.9810、0.9580、0.9820 mg·mL-1的對照品溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取山豆根藥材細粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入80%乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理30 min，再稱定重量，用80%乙醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取山豆根藥材細粉0.5 g，精密稱定，制備供試品溶液，連續(xù)進樣6針，采集色譜圖。以7號峰高麗槐素為參照峰，計算10個色譜峰的相對峰面積RSD在0.720%～3.4%，相對保留時間RSD在0.010%～0.11%，表明儀器的精密度較好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取山豆根藥材細粉，制備供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、18、24 h注入液相色譜儀進行分析，以7號峰高麗槐素為參照峰，計算10個色譜峰的相對峰面積RSD為0.80%～4.2%，相對保留時間RSD為0.010%～0.42%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批山豆根藥材細粉，稱取0.5 g，精密稱定，共6份，平行制備供試品溶液，進樣測定。以7號峰高麗槐素為參照峰，計算10個色譜峰的相對峰面積RSD為0.89%～4.0%，相對保留時間RSD為0.010%～0.19%。表明供試品溶液制備方法的重復性較好。

2.4 山豆根指紋圖譜的建立

2.4.1 指紋圖譜采集與相似度評價 取16批山豆根藥材樣品，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項下條件建立指紋圖譜并進行比較，共確定10個共有峰。山豆根指紋圖譜中峰7被鑒定為高麗槐素，是山豆根的主要活性成分，在該指紋圖譜中峰面積適中，峰位居中，分離度良好，保留時間和峰面積穩(wěn)定，因此選擇峰7作為參照峰。對10個共有峰進行統(tǒng)一積分后，將所得圖譜以cdf格式導入國家藥典委員會研制的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012版）”軟件進行處理，生成對照指紋圖譜。運用多點校正方法對16批樣品的共有峰進行匹配，得到指紋圖譜的疊加圖，計算16批山豆根的指紋圖譜與對照指紋圖譜的相似性，結果見圖1和表3。各批次相似度結果在0.926～0.989，表明以該指紋圖譜能夠有效表征山豆根藥材的整體化學特征，暫定樣品指紋圖譜與對照指紋圖譜比較，相似度不小于0.9，用于山豆根藥材的整體質(zhì)量控制。

圖1 16批山豆根藥材的UPLC指紋圖譜和對照指紋圖譜（R）Fig 1 UPLC fingerprint and control fingerprint（R）of 16 batches of Sophora Tonkinensis

表3 16批山豆根藥材UPLC指紋圖譜相似度評價結果 Tab 3 UPLC fingerprint similarity evaluation of 16 batches of Sophora Tonkinensis

2.4.2 共有峰相對保留時間和相對峰面積 計算16批山豆根指紋圖譜中各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD值。結果共有峰的相對保留時間的RSD值在0.01%～1.4%，相對峰面積的RSD值較大，說明各批次間成分含量存在較大差異。

2.4.3 指紋圖譜共有峰指認 取氧化苦參堿、三葉豆紫檀苷、山豆根素、高麗槐素對照品溶液以及山豆根藥材供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，采集色譜圖如圖2所示。通過比較保留時間和紫外光譜圖，鑒定峰2為氧化苦參堿，峰5為三葉豆紫檀苷，峰7為高麗槐素，峰9為山豆根素。

圖2 山豆根UPLC-UV指紋圖譜Fig 2 UPLC-UV characteristic spectrum of Sophora Tonkinensis

3 含量測定分析方法與結果

3.1 對照品溶液的制備

分別取三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素對照品適量，精密稱定，配制成三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素的質(zhì)量濃度分別為9.810、14.71、47.90 μg·mL-1的混合對照品溶液，搖勻，備用。

3.2 方法學考察

3.2.1 系統(tǒng)適用性考察 取對照品溶液及供試品溶液進樣檢測，記錄色譜圖（見圖3）。各化合物峰均能達到良好的分離，分離度均＞1.5，理論塔板數(shù)均不低于100 000。

圖3 山豆根UPLC-UV色譜圖Fig 3 UPLC-UV chromatogram of Sophora Tonkinensis

3.2.2 線性關系考察 取對照品儲備液適量，配制成含三葉豆紫檀苷49.05 μg·mL-1、高麗槐素73.57 μg·mL-1、山豆根素239.5 μg·mL-1的混合對照品溶液，用甲醇稀釋，得到系列濃度的混合對照品溶液，按“2.1”項下條件測定色譜圖，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標（x），峰面積為縱坐標（y）進行線性回歸分析，得回歸方程、相關系數(shù)及線性范圍，見表4。

表4 線性關系考察結果 Tab 4 Linear relationship

3.2.3 精密度試驗 取“3.1”項下對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素峰面積的RSD值分別為0.84%、0.52%、0.39%，表明儀器精密度良好。

3.2.4 重復性試驗 取同一批山豆根藥材樣品，稱取0.5 g，精密稱定，共6份，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，進樣測定。隨行測定對照品溶液計算含量，測得三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素含量的RSD值分別為2.5%、1.4%、1.9%，表明該方法重復性良好。

3.2.5 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、18、24 h進樣測定，計算三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素峰面積的RSD值分別為4.1%、1.5%、1.3%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.6 加樣回收試驗 稱取山豆根樣品共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別按已知成分含量的100%加入三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素的對照品，按“2.2.2”項下方法平行制備供試品溶液，進樣測定，計算三葉豆紫檀苷、高麗槐素、山豆根素的平均回收率分別為95.31%、96.14%、98.94%，RSD值分別為4.4%、1.4%、1.8%，表明該方法準確度良好。

3.3 山豆根藥材含量測定

取16批山豆根藥材樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算各成分含量，結果見表5。

表5 16批山豆根藥材的含量(%) Tab 5 Content of 16 batches of Sophora Tonkinensis (%)

4 討論

4.1 提取條件的優(yōu)化

本研究在供試品溶液的制備方面提取溶劑考察了水、甲醇（25%、50%、80%、100%）以及乙醇（25%、50%、80%、100%），提取方式考察了超聲提?。?0、60、90 min），回流提取（30、60、90 min）。研究發(fā)現(xiàn)利用加熱回流方法提取山豆根藥材時，峰6隨著加熱時間延長，其峰面積逐漸減小，而峰5隨著加熱時間延長，峰面積逐漸增加，兩者總峰面積基本不變，表明峰6加熱提取過程不穩(wěn)定，因此，為真實表征山豆根藥材化學成分，采用超聲提取的方法。比較發(fā)現(xiàn)，使用80%乙醇超聲提取30 min能夠獲得更全面的色譜峰和更高的峰強度，因此，選擇80%乙醇超聲提取30 min。

4.2 色譜條件的優(yōu)化

采用PDA檢測器在200～400 nm波長內(nèi)進行掃描，提取不同波長下的色譜圖，發(fā)現(xiàn)在203 nm波長下色譜峰較多，峰強度均勻適中，且待測物均具有最大吸收。對色譜柱Acquity UPLC BEH C18柱和Waters Acquity UPLC HSS T3柱，流動相甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水（0.05%、0.1%、0.2%），柱溫23、25、27℃，流速0.24、0.3、0.36 mL·min-1進行考察，最終選擇本文的色譜條件。

4.3 用于山豆根藥材整體質(zhì)量控制的分析

山豆根含有生物堿、黃酮、三萜、有機酸等多種活性次生代謝產(chǎn)物，然而目前《中國藥典》僅對其所含有的苦參堿和氧化苦參堿進行控制，存在專屬性差和藥效關聯(lián)性差的不足?？鄥A和氧化苦參堿具有抗炎鎮(zhèn)痛[13]、抑菌[14]、抗腫瘤[15-16]等廣泛的藥理作用，因此傳統(tǒng)認為苦參堿和氧化苦參堿為山豆根的主要有效成分，并規(guī)定其在山豆根中含量總和不低于0.70%。近年來，山豆根非生物堿類成分受到關注，研究發(fā)現(xiàn)山豆根氯仿部位具有顯著的抗鼻咽癌作用，成分分析表明該部位主要含有三葉豆紫檀苷、高麗槐素、染料木素等非生物堿類成分[17]。因此，有必要對山豆根生物堿、黃酮等成分進行全面分析，建立整體化學成分表征方法，有效控制山豆根藥材質(zhì)量。本研究利用超高效液相色譜法，通過優(yōu)化提取方法和色譜條件，建立了涵蓋氧化苦參堿、高麗槐素、三葉豆紫檀苷、山豆根素等10個共有成分峰的指紋圖譜測定方法，測定了來自廣西、廣東、貴州三大產(chǎn)地的16批山豆根藥材，表明各產(chǎn)地山豆根相似度較高，有效表征了山豆根藥材的整體物質(zhì)基礎，可以整體化學組成上控制山豆根藥材的質(zhì)量。

《中國藥典》規(guī)定了山豆根藥材中苦參堿和氧化苦參堿的含量，為進一步控制黃酮類成分的含量，本研究在指紋圖譜測定基礎上，選擇含量較高的高麗槐素、三葉豆紫檀苷、山豆根素作為質(zhì)控成分建立含量測定方法。蘇雯清等[18]研究發(fā)現(xiàn)高麗槐素可顯著抑制鼻咽癌細胞CNE-1的增殖、克隆與遷移，并且可促進細胞凋亡。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)三葉豆紫檀苷可以通過抑制m-TOR/PI3K/AKT信號通路，誘導胃癌細胞自噬和線粒體介導的凋亡。Kajimoto等[20]發(fā)現(xiàn)山豆根素可以誘導人白血病U937細胞凋亡。高麗槐素、三葉豆紫檀苷、山豆根素都有明確的抗腫瘤活性，可能是山豆根抗腫瘤作用的主要有效成分。因此，本研究同時測定指紋圖譜和高麗槐素、三葉豆紫檀苷、山豆根素的含量，與《中國藥典》含量測定項相結合，為山豆根藥材的整體質(zhì)量提供了有效的評價方法。黃樂等[11]對7個產(chǎn)地的山豆根成分含量進行測定，發(fā)現(xiàn)高麗槐素含量在0.05%～0.11%，何常明等[21]對17個批次的山豆根中的黃酮類成分進行含量測定，發(fā)現(xiàn)三葉豆紫檀苷的含量在0.05%～0.20%，含量波動范圍與本研究結果基本一致，本研究首次測定了山豆根藥材中山豆根素的含量，以往文獻未見報道。16批山豆根中3種成分的含量有較大差異，可能與不同產(chǎn)地以及采收日期等因素有關。

本試驗利用UPLC-UV法建立了山豆根藥材的指紋圖譜，并測定了高麗槐素、山豆根素以及三葉豆紫檀苷的含量，為山豆根整體質(zhì)量評價提供了新方法，為山豆根的質(zhì)量控制提供了參考。