川芎嗪通過調控mTOR的表達減輕細菌脂多糖誘導的臍靜脈內皮細胞內皮屏障破壞

高可飛 劉小碣 丁渡山 閔思敏 李言 張永

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)可并發肺不張和ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)[1-2]，給我國造成了巨大的經濟負擔。ALI關鍵的病理特征是肺血管內皮屏障完整性的破壞[3-4]。因此，靶向保護血管內皮屏障的完整性可能是治療ALI的新方向。川芎嗪(TMP)是從植物川芎中提取的一種活性物質，可抑制炎癥，在ALI的治療中發揮著重要作用[5-7]，但是具體的治療機制尚不清楚。mTOR(哺乳動物雷帕霉素靶蛋白)屬于PI3K(一種胞內磷脂酰肌醇激酶)相關激酶家族，在急性肺損傷中發揮著重要調控作用[8],并可促使細胞骨架破壞[9-10]。然而，目前對于mTOR在ALI中內皮通透性的研究較少。本研究采用LPS刺激的細胞模型，研究川芎嗪對于LPS誘導的HUVEC細胞骨架和內皮細胞通透性的作用，并探尋可能的作用機制。

資料與方法

一、材料

1 臍靜脈內皮細胞獲取

蚌埠醫學院第一附屬醫院手術室取健康產婦足月剖宮產臍帶(標本獲取經過蚌埠醫學院倫理委員會批準，批號：倫動科批字[2016]第015號)，放入保存液(M199培養基配制)冷藏至實驗室。無菌條件下PBS和預冷酒精沖洗臍帶表面。再用37℃預熱的PBS沖洗臍靜脈血管，直到下端流出液體澄清。注入Ⅰ型膠原酶進行內皮細胞消化，放入裝有預熱PBS的無菌瓶子中，一起放入37℃水浴鍋中不斷翻動、震蕩消化5～10分鐘。將消化好的液體放入離心管中，再用ECM培養基進行沖洗2遍。1000轉離心10分鐘。棄上清，用ECM培養基重懸細胞沉淀，種于培養瓶(皿)中，37℃，5% CO2培養箱中培養。

2 試劑

磷酸川芎嗪(中國藥品生物制品鑒定所)；LPS及FITC標記的葡聚糖(Sigama)；ECM培養基(ScienCell)；M199、胰酶細胞消化液、DAPI(Biosharp)；PMSF和RIPA裂解液、4%多聚甲醛(碧云天)；transwell培養板(LABSELECT)；VWF抗體、抗熒光淬滅劑(博士德)；p-mTOR(CST)、mTOR(CST)、viculin(proteintech)；磷酸酶抑制劑(Roche)；FITC標記的鬼筆環肽(索萊寶)；CY3標記的熒光二抗(Jackson)。

二、方法

1 內皮細胞鑒定

細胞用胰酶消化后，重懸制成細胞懸液。滴加于細胞爬片上。放入37℃，5%CO2培養箱中培養過夜。第二天用DMEM培養基清洗1次。然后加入預冷的4%多聚甲醛固定細胞。PBS清洗3次。加入0.5%TritonX-100 穿孔。PBS清洗3次。滴加VWF相關抗原抗體4℃孵育過夜。第二天吸出抗體，PBS清洗3次。滴加稀釋好的熒光二抗CY3抗體，孵育2小時。PBS清洗3次。吸干PBS，取出爬片，滴加抗熒光淬滅劑于載玻片并將爬片放入，指甲油外周封片。蔡司熒光顯微鏡上拍照。

2 分組

將培養好的細胞按照加藥處理的不同分為空白對照組、LPS組(LPS刺激12 h，濃度為400ng/μL)、TMP(TMP預保護12 h后加LPS刺激12 h，濃度為60μg/mL)+LPS組。

3 免疫熒光

(1)將細胞用消化計數后制成細胞懸液。滴于細胞爬片上。放入37℃，5%CO2培養箱中培養過夜。(2)第二天加藥處理(LPS、TMP)。(3)用DMEM培養基進行清洗1次，然后加入預冷的4%多聚甲醛固定。PBS清洗3次。(4)加入0.5%TritonX-100穿孔。PBS清洗3次。(5)避光滴加FITC標記的鬼筆環肽，避光孵育30分鐘PBS清洗3次。(6)滴加DAPI避光孵育3分鐘，PBS沖洗5次。吸干PBS。(7)取出爬片，放入滴加有抗熒光淬滅劑載玻片上。指甲油外周封片。蔡司熒光顯微鏡上拍照。

4 跨內皮電阻實驗

將細胞消化計數后，種于含有Transwell小室的24孔板，測基礎電阻值(含培養液)，并12小時測電阻一次。待電阻值達到平臺期加藥(LPS、TMP)處理,檢測加藥后12小時電阻值。TEER 值按以下公式計算：TEER 值(單位:Ω×cm2)=(內皮細胞電阻值-基礎電阻)×Transwell 上室濾膜的底面積(0.33 cm2)。

5 細胞通透性實驗

將細胞消化計數后，種于含有transwell小室(底面積0.33cm2)的24孔板，達到70%融合度時加藥處理(LPS、TMP)。處理結束后，吸出原有培養基。將下室更換為不含血清的ECM培養基600μl，上室加入FITC標記的葡聚糖溶液(500 μg/mL)200 μL。在 37℃、5%CO2細胞培養箱內孵育 1 h 后，從每個嵌套小室上層和下層分別取液 100 uL，加入黑色 96 孔板中，避光，用 Synerge II 多功能酶標儀測定 Transwell 小室上下雙層液體中的熒光強度值，激發光波長 485nm，發射光波長 528 nm。內皮細胞單層對葡聚糖通透性的大小用通透系數 Pa 表示，Pa 計算公式：Pa=[A]/t×1/A×V/[L]

注：[A]為下室熒光強度值；t為FITC—葡聚糖孵育時間(單位：秒)；A為小室濾膜面積(單位：cm2)；V為下室液體量；[L]為上室熒光強度值。實驗結果以Pa%表示。Pa%=(實驗樣品組Pa/實驗對照組 Pa)×100%

6 蛋白印跡法(westernblot)

將提取好的蛋白，用BCA方法測定濃度。制好膠后加入各組蛋白樣品，90v濃縮膠電泳，到分離膠之后更換為120v電泳至到底部。將電泳好的膠進行轉膜，將PVDF膜貼于目的條帶處，采用三明治方法轉膜。BSA封閉，一抗4℃孵育過夜。第二天TBST洗膜三次后，孵育對應種屬的二抗2小時。洗膜3次后，顯影儀上曝光。

7 熒光定量PCR(qPCR)

細胞RNA提取操作應用試劑盒(諾唯贊RNA提取試劑盒)方法提取，嚴格按照說明書操作，提取完畢應用酶標儀檢測A260/280吸光度，確定RNA的純度及濃度。然后進行逆轉錄及qPCR(應用諾唯贊試劑盒)。qPCR引物序列為mTOR：Forward Primer GCAGATTTGCCAACTATCTTCGG，Reverse Primer CAGCGGTAAAAGTGTCCCCTG。按照試劑盒說明書配制體系，上機進行檢測。

三、統計學方法

結 果

一、應用VWF抗體(Ⅷ因子抗體)進行臍靜脈內皮細胞鑒定，結果(見圖1)。內皮細胞呈現紅色。

圖1 臍靜脈內皮細胞鑒定(200×，標尺50 μm)

二、TMP可減少LPS誘導的臍靜脈內皮細胞應力纖維的形成。

三組免疫熒光細胞骨架染色結果表明，LPS組較空白對照組應力纖維明顯增粗、增多，加入TMP治療后應力纖維較LPS組明顯減少、變細(見圖2)。

圖2 三組免疫熒光細胞骨架趨勢(200×，標尺：50 μm)

三、TMP可部分逆轉LPS誘導的臍靜脈內皮細胞TEER值的降低

種入細胞后，TEER值隨時間增長呈現明顯增加趨勢，尤其于36～48小時增加最明顯。于48～60小時達到平臺期(見圖3)。于平臺期加藥處理后，結果表明加藥0小時三組電阻值差異未到達統計學意義(F=3.233,P=0.112>0.05)，而加藥處理12小時后，LPS組跨膜電阻值較空白組明顯降低(t=16.49，P<0.001,)，而TMP治療組較LPS組跨膜電阻值明顯增加(t=7.924，P=0.001)(見圖4)。

圖3 種入細胞后TEER值隨時間變化圖

圖4 加入LPS和TMP處理后各組電阻值變化趨勢圖

四、TMP可減輕LPS誘導的內皮細胞通透性增加

LPS組通透系數較對照組明顯增加(t=18.26，P<0.001)，而TMP治療組通透系數較LPS組降低(t=6.834，P=0.002)(見圖5)。

圖5 三組細胞通透性結果比較

五、TMP對LPS誘導的mTOR水平變化的影響

應用熒光定量PCR技術，檢測mTOR的相對表達水平，結果發現LPS組較對照組mTOR表達量明顯增加(t=7.684，P=0.002)，而TMP治療組mTOR表達量下降(t=3.069，P=0.040)(見圖6)。

圖6 三組qRCR mTOR相對表達量的差異

蛋白印跡法(westernblot)(如圖7、8)所示：應用蛋白印跡法檢測三組mTOR和p-mTOR的表達量，結果表明LPS組較對照組p-mTOR/mTOR較明顯上升(t=2.841，P=0.047<0.05)，而TMP治療組較LPS組則有明顯下降。(t=2.804，P=0.049<0.05)

圖7 三組Westernblot條帶圖

討 論

Webel ER等在上世界60年代首次發現血管內皮細胞胞漿中存在桿狀和管狀的物質，80年代Jaffe進一步研究認為 VWF相關抗原免疫熒光檢測最為可靠 ,因為在人體內，除內皮細胞外,僅在血小板和巨核細胞中存在VWF因子相關抗原 ,故可與血管平滑肌和成纖維細胞相鑒別。目前常應用Ⅷ因子作為內皮細胞鑒定標志物，這可能是由于Ⅷ因子可特異性沉積于Weibel-Palade小體，而Weibel-Palade小體是內皮細胞所特有的桿狀細胞器。本研究采用Ⅷ因子抗體對分離的人臍帶血管內皮細胞進行鑒定，結果與報道的一致。

圖8 三組Westernblot條帶對應統計圖

細胞骨架由相互連接的細絲狀結構組成，主要包括:肌動蛋白微絲、微管和中間細絲。為細胞提供結構支持并維持多細胞組織的穩定。細胞骨架對于維持細胞形態和細胞內物質運輸、細胞器的移動起著不可替代的作用。肌動蛋白細胞骨架，是一種高度動態的結構，在調節內皮細胞連接的穩定性和血管通透性方面起著至關重要的作用。研究證明內皮屏障的完整性依賴于體內肌動蛋白的形態[11]。應力纖維被認為增加向心張力，因此可能介導細胞-細胞邊界收縮，有利于細胞旁間隙的形成[12]。炎癥介質及通透性增加藥物等物質，可誘導內皮細胞屏障破壞和肌動蛋白應力纖維的形成，最終導致內皮細胞骨架的促收縮變化和細胞間隙增大，包括Rho信號的激活導致肌球蛋白輕鏈磷酸酶(MLCP)的抑制，隨后是肌球蛋白輕鏈磷酸化的增加、收縮的啟動和細胞旁通透途徑的開放。內皮細胞高通透性是肺損傷的一個重要病理過程，并可導致不良結局。細胞間粘附和細胞骨架收縮力之間的不平衡會導致內皮細胞通透性過高，因此，內皮屏障的調節依賴于細胞骨架的重新排列[4]。LPS作為一種炎癥介質可增加細胞通透性、應力纖維形成、肌動蛋白收縮和細胞旁間隙形成[13-14]。本研究發現加入LPS刺激后可誘導HUVEC應力纖維增加，并明顯增粗。與之前報道的一致。而經過川芎嗪治療后應力纖維較LPS刺激組則變細、減少。進一步說明TMP治療，可逆轉LPS誘導的ALI所造成的細胞骨架破壞，并且起到對細胞和內皮屏障保護作用。

血管內皮細胞形成半通透性屏障隔開血液與組織，并可允許特定的物質進行跨膜轉運，發揮正常的生理過程。內皮連接分離，是細胞受到炎癥介質刺激導致的細胞屏障功能障礙的主要標志。本研究結果表明，LPS刺激后HUVEC細胞通透系數明顯增加，而應用TMP治療后通透系數較LPS組則明顯下降，表明TMP可通過降低細胞通透性來保護LPS誘導的ALI。雖然異硫氰酸熒光素(FITC)標記的葡聚糖不能用來動態監測細胞屏障的完整性。但跨上皮/跨內皮電阻(TEER)是跨單層細胞電阻的測量，是確認單層細胞完整性和通透性的非常敏感和可靠的方法，其可用來監測細胞的增殖和生長狀況[15]。本研究中，種入HUVEC細胞后隨著時間的增長，TEER值呈上升趨勢，36～48小時TEER增長迅速，于48小時達到平臺期。然而加入LPS后，TEER值較空白對照組明顯降低[16]，而經過TMP治療后，TEER值較LPS組明顯有所升高。與異硫氰酸熒光素(FITC)標記的葡聚糖結果一致，LPS可誘導單層內皮細胞通透性及TEER值變化，導致細胞屏障的破壞。單層細胞TEER值隨著細胞數量的增加而增加，直到達到平臺期，而TEER的顯著降低證明了內皮屏障系統的完整性遭到破壞[17]。因此，TMP不僅可保護細胞骨架的完整性,而且還可通過降低內皮細胞通透性來進一步治療ALI。

近年來研究發現mTOR信號通路不僅在腫瘤性疾病的發生、發展以及治療上發揮重要的作用[18-20]，而且在ALI的治療上也發揮著舉足輕重的作用[8,21-22]。Wu[21]等人研究發現通過抑制mTOR活性可以促使支氣管上皮和小鼠氣道上皮細胞的自噬活性增加，進一步削弱溶酶體的活性，從而引起肺損傷的產生。Li等[23]還發現PI3K/Akt/mTOR通路還可誘導肺DCs(樹突狀細胞)的成熟和增強其抗原提呈能力，顯著升高髓系DCs，增強肺DCs的粘附和趨化能力，最終對肺損傷的保護作用。這些研究表明mTOR信號通路的激活可能對肺損傷起著重要的保護作用。然而，還有一些研究表明mTOR信號通路活性的激活可能加重ALI的發生發展[24-26]。不僅如此，F-肌動蛋白細胞骨架的重排，涉及多種蛋白激酶信號通路，包括哺乳動物靶點雷帕霉素(mTOR)。最近研究表明IGF-1激活mTOR通路，可調節F-肌動蛋白的細胞骨架組織[27]。因此，mTOR蛋白在細胞骨架和肺損傷中發揮關鍵的調控作用。另外，本課題組前期已經證實TMP可通過Rac1/LIMK1信號通路來保護LPS誘導的HUVEC細胞的損傷[28]，mTOR作為Rac1/LIMK1信號通路的上游蛋白，可能在調節細胞骨架及維持內皮屏障的完整性中也起著重要作用。本研究中利用western blot技術檢測了三組mTOR和p-mTOR的表達量并應用qPCR技術檢測其mRNA的表達水平，結果發現LPS組較對照組p-mTOR/mTOR明顯上升，TMP治療后則有明顯下降，這與文獻報道的一致[29]，這可能是由于LPS刺激后增加了炎癥細胞浸潤和抑制自噬所造成。本研究的結果表明LPS可使mTOR表達變化，mTOR蛋白變化可能導致細胞骨架重排，應力纖維形成增加，進一步導致細胞-細胞連接分離和細胞旁間隙增加、細胞屏障破壞，滲透性增加，從而最終加重肺損傷的發生。這與之前報道的mTOR激活加重肺損傷的結果相一致。這表明mTOR可能參與了HUVEC損傷的發生，并且引起其病理上細胞骨架的破壞、TEER異常下降和單層細胞通透系數的明顯增加，最終使細胞和組織水腫、壞死，引起不良結局。

本研究未進行動物模型來驗證其可靠性，這是其局限性。但是將來我們將通過動物實驗來模擬體內環境進一步驗證以上結果的準確性。

總之，本研究的結果說明TMP治療可減少LPS引起的內皮細胞mTOR表達及細胞骨架應力纖維增粗增多，不僅如此，TMP還可逆轉LPS導致的內皮細胞單層細胞通透性增加和TEER降低。因此，TMP可通過抑制mTOR的表達量，在LPS誘導引起的內皮細胞屏障功能障礙中起著重要的保護作用，其可作為治療急性肺損傷的一個重要靶點。