薯蕷皂苷通過p38MAPK/NF-κB通路對支氣管哮喘幼鼠氣道炎癥及氣道重塑的作用機制研究

齊莎莎 張國偉 張旭亞 付曉梅

支氣管哮喘(bronchial asthma，BA)是常見的慢性呼吸道疾病，常發于3歲以下兒童，臨床表現為反復性氣促、咳嗽、喘息等[1]。流行病資料調查顯示[2]，BA發病率逐年上升，全球確診人數超過2億人。目前臨床治療BA通常采用激素吸入療法，可有效減輕炎癥反應，短期內改善氣喘癥狀，但對于重癥及激素抵抗型患兒療效并不理想，且可引發失聲、骨質疏松、霉菌性咽炎等不良反應[3]。因此，探索高效、安全的BA治療藥物，對于減少其發作、減輕發作程度、改善患兒生存質量意義重大。薯蕷皂苷(diosgenin，Dio)提取自中藥穿龍薯蕷，具有增強性功能、降血脂、抗炎、抗腫瘤等藥理作用[4]。有研究表明[5]，Dio可抑制肺組織病理變化及炎性細胞浸潤，從而減輕急性肺損傷。但目前關于其用于BA治療的報道尚少，且缺乏對應的機制研究。本研究通過建立BA幼鼠模型，研究Dio對其治療作用，并探討相關機制。

資料與方法

一、實驗動物

無特定病原體(Specific pathogen Free,SPF)級雄性BALB/c幼鼠40只，7日齡，體質量(5.45±0.35)g，購自上海靈暢生物科技有限公司，生產許可SCXK(滬)2018-0003。

二、藥物、主要試劑、儀器

Dio(純度>98%，上海一研生物科技有限公司)，p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK)/核轉錄因子-κB(nuclear factor κB，NF-κB)信號通路激活劑anisomycin(上海源葉生物科技有限公司)，白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)酶聯免疫吸附實驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒(上海聯碩生物科技有限公司)，兔抗幼鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB、p-NF-κB、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2)、p-ERK1/2蛋白一抗(美國R&D公司)。

流量型整體體積描記箱、整體體積描記系統(美國Buxco公司)，DP12光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)，iMark酶標儀(美國Bio-Rad公司)，DYCZ-40B電泳儀、WD-9413一體式凝膠成像系統(北京六一生物科技有限公司)。

三、建立BA幼鼠模型[6]

取全部BALB/c幼鼠，隨機選擇10只設為Control組，其余30只幼鼠建立BA模型，腹腔注射致敏劑(卵清蛋白20 μg與氫氧化鋁2 mg混合溶液)0.1 mL，致敏14天后同劑量注射二次致敏，第24天霧化吸入卵清蛋白生理鹽水溶液8 mL，每天1次，持續3天。建模完成后觀察幼鼠出現呼吸急促、頻繁噴嚏、異常躁動等現象，表示建模成功。成功30只，隨機分為BA組、Dio組、Dio聯合anisomycin組，各10只。

四、干預方式

Dio組灌胃Dio生理鹽水溶液1 mL(含藥量80 mg/kg)，Dio聯合anisomycin灌胃Dio生理鹽水溶液1 mL(含藥量80 mg/kg)后腹腔注射Anisomycin 2 mg/kg，Control組、BA組灌胃、腹腔注射等體積生理鹽水。每天1次，持續2周。

五、檢測肺功能指標

末次干預后4 h切開幼鼠頸部，找出其第3與第4氣管，行倒T型氣管插管于氣管環中并勒緊插管，連接呼吸機放置于體描箱內，采用AniRes 2005軟件監測并記錄幼鼠肺容積(lung volume，LV)及每分鐘靜息通氣量(resting ventilation per minute,VE)。

六、檢測肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)炎癥因子IL-1β、TNF-α水平

幼鼠肺功能指標檢測后，腹腔注射戊巴比妥鈉深度麻醉，脫頸處死，迅速摘取左右兩肺，右肺分成兩份，一份用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋并切片后用于HE染色，一份投入液氮中用于蛋白檢測；左肺用生理鹽水0.3 mL灌洗5次，回收BALF，4℃離心取其上清。采用ELISA法檢測BALF中IL-1β、TNF-α含量，按照試劑盒說明書要求設計實驗步驟，酶標儀測定波長570 nm位置吸光度值，畫出標準曲線計算IL-1β、TNF-α水平。

七、HE染色測量氣道重塑指標、觀察肺組織病理變化

取肺組織切片，常規脫蠟，無水酒精沖洗后自來水沖洗20 s，加入蘇木精液染色，自來水沖洗，鹽酸酒精分化，自來水沖洗后促藍液反藍，伊紅液染色2 min，梯度酒精脫水、透明、晾干，封片劑封片，每張切片隨機選取5個不相鄰視野，拍照測量膜性細支氣管(直徑750～1100 μm，長徑/短徑≥0.7 μm)管壁外徑、面積、厚度及氣管總面積，計算MT%、MA%。MT%=管壁厚度/外徑，MA%=管壁面積/氣管總面積；光學顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

八、Western blot法檢測肺組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

取液氮保存的肺組織研磨器研磨，加入PBS洗滌勻漿后，注入離心管，RIPA裂解液裂解，冰上8 000 r/min離心20 min(離心半徑10 cm)，經BCA試劑盒定量蛋白。取50 μg樣品按比例與上樣緩沖液混合，金屬浴加熱5 min，離心取其上清，電壓80 V行上樣電泳分離后，改電壓110 V濕轉PVDF膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗膜，加入兔抗幼鼠p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2一抗(1：500)，4 ℃孵育2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗(1:2 000)，常溫孵育2 h，TBST洗膜，加入ECL發光液顯色，暗室曝光，經一體式凝膠成像系統掃描拍照，分析灰度值，以目的蛋白灰度值/內參GAPDH灰度值表示蛋白相對表達量。計算p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2。

九、統計學處理

結 果

一、肺功能

與Control組比較，BA組LV、VE減少(P<0.05)；與BA組比較，Dio組LV、VE增加(P<0.05)；與Dio組比較，Dio聯合anisomycin組LV、VE減少(P<0.05)(見表1)。

表1 各組幼鼠肺功能指標比較

二、BALF中炎癥因子水平

與Control組比較，BA組IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)；與BA組比較，Dio組IL-1β、TNF-α水平降低(P<0.05)；與Dio組比較，Dio聯合anisomycin組IL-1β、TNF-α水平升高(P<0.05)(見表2)。

表2 各組幼鼠BALF中炎癥因子水平比較

三、氣道重塑指標

與Control組比較，BA組MT%、MA%升高(P<0.05)；與BA組比較，Dio組MT%、MA%降低(P<0.05)；與Dio組比較，Dio聯合anisomycin組MT%、MA%升高(P<0.05)(見表3)。

表3 各組幼鼠氣道重塑指標比較

四、HE染色觀察肺病理學改變

Control組肺組織及肺泡腔均具有清晰、完整的結構，肺泡壁未觀察到滲出、增寬，肺泡間隔、支氣管管腔中無炎性細胞浸潤、水腫、分泌物滲出；BA組肺泡壁厚度不一，血管壁厚度增加，肺部血管周圍存在大量炎性細胞浸潤，肺泡上皮細胞及肺間質細胞增生，肺泡數量明顯減少；Dio組、Dio聯合anisomycin組干預后肺部炎性細胞浸潤減弱，病理癥狀有所緩解，Dio組改善效果較Dio聯合anisomycin組明顯(見圖1)。

圖1 HE染色觀察各組非組織病理變化(×400，標尺25 μm)

五、肺組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2比較

與Control組比較，BA組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)；與BA組比較，Dio組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2降低(P<0.05)；與Dio組比較，Dio聯合anisomycin組p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高(P<0.05)(見表4，圖2)。

表4 各組幼鼠肺組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

圖2 Western blot法檢測肺組織p38 MAPK、p-p38 MAPK、NF-κB p65、p-NF-κB p65、ERK1/2、p-ERK1/2蛋白表達

討 論

BA是多種細胞和炎癥介質參與的變態反應性氣道炎癥疾病，鼻炎、反復性呼吸道感染、居住環境過敏原及濕疹是其主要危險因素[7-8]。BA發病機制復雜，目前認為與黏液高分泌、慢性氣道炎癥、氣道高反應性、氣道重塑、遺傳及免疫反應等有關[9]。中醫認為哮喘屬于“哮病”范疇，病機主要為肺脾虧虛、宿痰堆積，即肺脾不固，外邪侵入客居于肺，阻塞氣機而肺氣郁滯，以致痰濁內蘊而發哮喘，故治療應以益肺、固本、祛痰為主[10]。

氣道炎癥反應是引發BA的基礎，其表現為Th2細胞釋放IL-1β、IL-4、IL-5等炎癥因子刺激氣道分泌過量黏液、引發平滑肌痙攣并激活嗜酸性粒細胞聚集至氣道周圍，引發慢性炎癥反應，肥大細胞受到刺激，釋放存儲的TNF-α，激活炎癥細胞，加重炎癥反應[11]。氣道重塑與慢性炎癥密切相關，可導致氣道高反應，是肺功能損傷的病理標志之一，其涉及氣道內多個組織及細胞異常變化，包括上皮細胞基底膜增厚、成纖維細胞增生、支氣管壁增厚、管腔收縮及微血管面積增加等[12]。本研究結果顯示，與BA組比較，Dio組LV、VE增加，IL-1β、TNF-α水平，MT%、MA%，肺組織病理損傷減輕，提示Dio可提升肺功能，減輕BA氣道炎癥反應及肺組織病理學變化，抑制氣道重塑。Dio是甾體總皂苷的一種，現代藥理學研究表明其具有增強機體免疫功能、抑制血小板聚集、增強心血管功能及抗腫瘤等功效，可用于甾體激素類藥物合成[13]。Wu等[14]在研究小鼠肺炎模型時發現，Dio可通過抑制TNF-α、IL-1β水平，減輕炎癥反應，抑制肺纖維化，從而治療急性肺損傷，提示其在呼吸道疾病治療中的抗炎效果，本研究結果與其具有部分相似性。

p38MAPK/NF-κB信號通路是機體重要的炎癥及免疫通路，p38 MAPK、ERK是其級聯反應調控因子，在細胞生長發育、增殖分化和凋亡等過程發揮重要作用[15]。NF-κB是核轉錄因子蛋白，可調節機體炎癥及免疫反應。當機體進入應激狀態后，p38 MAPK、NF-κB被激活發生磷酸化，由細胞質轉移至細胞核內，促使相關基因轉錄，上調炎癥因子表達，其級聯反應信號刺激ERK1/2活化并聚集，誘發轉錄因子磷酸化，進一步促進炎癥反應發生及發展[16]。有研究表明[17]，抑制p38MAPK/NF-κB信號通路可抑制小鼠肺組織炎癥因子水平，減少黏液分泌，從而治療小鼠過敏性鼻炎聯合哮喘綜合征，提示該通路在呼吸系統疾病中起到重要作用。本研究結果顯示，與Control組比較，BA組肺組織p-p38 MAPK/p38 MAPK、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-ERK1/2/ERK1/2升高，經Dio干預后均降低，且在Dio基礎上增用p38MAPK/NF-κB信號通路激活劑anisomycin可減弱Dio對BA的治療作用，提示p38MAPK/NF-κB信號通路在BA中異常激活，Dio可能通過抑制該通路對BA幼鼠氣道產生治療作用。

綜上所述，Dio可減輕BA幼鼠氣道炎癥反應，抑制氣道重塑，可能與抑制p38MAPK/NF-κB信號通路有關。