宏基因二代測序技術在支氣管肺泡灌洗液病原檢測中的臨床應用

任小宏 代繼宏

在兒童呼吸系統疾病中，順位排名第一的疾病分類類目是肺部感染，是最常見的兒童死因之一[1-2]。據報道，我國每天至少有約1000名左右的5歲以下兒童因感染肺炎而死亡[3]，肺炎死亡原因中與病原體感染相關占有62%[4]，可見確診兒童肺部感染的病原學顯得尤為重要。長期以來，研究主要依靠傳統病原菌培養，其方法時間長、陽性率低，對未知病原體無法檢測[5]。宏基因二代測序(metagenomic next-generation sequencing，mNGS)可以無偏倚地檢測出所有潛在病原體，指導用藥，降低死亡率。故宏基因二代測序技術對重癥或難治性的兒童肺部感染的診斷和治療具有重要價值。本研究回顧性的分析了部分重癥或難治性的兒童肺部感染患者的灌洗液宏基因二代測序檢測的病原學結果，為mNGS的臨床應用提供參考。

資料與方法

一、研究對象

收集2020年1月至2020年10月在重慶醫科大學附屬兒童醫院住院治療的46例重癥或難治性肺部感染患者的臨床資料，包括：年齡、性別、臨床表現、行mNGS檢測前的住院天數、行mNGS檢測前使用丙球、行mNGS檢測前使用抗生素、影像學改變、實驗室檢查、傳統培養的病原學結果與支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測的病原學結果等基本情況，并對其進行統計及分析，資料真實、可靠且準確。對于兒童社區獲得性肺炎(CAP)的診斷標準將按照國家衛生健康委會同國家中醫藥管理局組織制定的2019年版兒童社區獲得性肺炎診療規范[6]診斷。

二、方法

1 標本采集 支氣管肺泡灌洗液標本：通過規范化培訓的專業的支氣管鏡醫師在全麻下行支氣管鏡檢查及支氣管肺泡灌洗術，通過吸收器吸引并獲取支氣管肺泡灌洗液[7]，回收的支氣管肺泡灌洗液分為兩管，分別行支氣管肺泡灌洗液培養和支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測，其樣本量分別不低于3 mL和5 mL。痰液樣本：如果建立了人工氣道，則使用一次性痰液收集器獲取痰液；如果沒有建立人工氣道，早晨收集痰液，在留痰前用少量水漱口至少3次，然后用力呼吸，咳出深部呼吸道的痰，并將其放入痰盒中，采集的痰液標本量不得少于1 mL；標本每次收集后均立即進行送檢。

2 病原菌檢測 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測：本實驗的檢測結果利用illumina公司的高通量測序技術對樣品中的病原微生物進行全面檢測和分析，并與數據庫中的核酸序列進行比較，進一步確定樣品中可疑的致病微生物。傳統培養檢測：采用法國生物梅里埃生產的VITEK 2 COMPACT檢測儀進行病原體鑒定，并根據《全國臨床檢驗操作規程》進行相關操作。

3 觀察指標 觀察患者的臨床資料：性別、年齡、臨床癥狀、行mNGS檢測前的住院天數、行mNGS檢測前使用丙球、行mNGS檢測前使用抗生素、影像學改變、實驗室檢查[8]等。

三、統計學分析

采用SPSS 25.0統計軟件進行統計分析，分類變量資料采用例數(構成比)表示，使用卡方檢驗進行比較分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、一般資料

回顧性分析2020年1月至2020年10月在重慶醫科大學附屬兒童醫院住院治療的46例重癥或難治性的肺部感染患者的臨床資料，其中男24例(52.2%)、女22例(47.8%)；年齡在2月～15歲之間，平均年齡為7.5歲。

二、支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養檢測陽性率的比較(見表1)

表1 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養檢測陽性率的比較[n(%)]

通過表1，可見支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率明顯高于傳統培養，差異有統計學意義(χ2=25.348，P<0.05)。

三、支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養檢測的病原體分布(見表2)

表2 兩種不同的檢測方法的病原體分布

42例患者支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測結果陽性，共檢測到103株病原體，其中有檢測到細菌、真菌、病毒、沙眼衣原體。17例患者傳統培養檢測結果陽性，共檢測到24株病原體，均為細菌。分析發現支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測對病毒、真菌、細菌、特殊的病原體檢測陽性率高于傳統培養(見圖1)。

圖1 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養的病原體種類分布

四、支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養在病原體檢測上的一致性比較(見表3)

表3 支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養病原學檢測一致性比較

支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測與傳統培養檢測均陽性患者15例，其中2例檢測的病原體一致，13例檢測的病原體不一致；27例支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測陽性，但傳統培養結果陰性；3例支氣管肺泡灌洗液mNGS與傳統培養結果均陰性，可見其一致性差。

五、不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽性檢出率的比較

搜集46例行支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測患者的臨床資料，包括患者性別、年齡、臨床癥狀、行mNGS檢測前的住院天數、行mNGS前使用丙球、行mNGS前使用抗生素、影像學提示肺炎、實驗室檢查等，比較不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽性檢出率。

通過表4，發現行支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測前影像學提示肺炎、PCT有統計學意義(P<0.05)；其余指標組間差異均沒有統計學意義(P>0.05)。

表4 不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽性檢出率的比較 [n(%)]

討 論

隨著現代科學的不斷發展，在兒童疾病譜中呼吸系統疾病一直位于首位，肺炎成為呼吸系統疾病最多見的[1-2]，而因病原體直接感染而導致兒童死亡的肺炎占62%[4]，兒童肺部感染性疾病對兒童的身體健康影響巨大，這就需要更先進的診療技術幫助診斷與治療，對于兒童感染性肺部疾病來講，最主要的問題是如何找到病原學，從而對臨床用藥提供幫助，進一步提高治療效果，減少死亡率，而既往的檢查有其局限性，mNGS以其高通量、快速檢測和其高敏感性等優勢，進一步在感染性疾病中，起到了重要的作用。

研究結果顯示支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測和傳統培養檢測的陽性率分別為91.3%、36.9%，可見支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測陽性率遠遠高于傳統培養，與既往文獻報道具有一致性[9-11]，進一步說明采用支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測可以提高病原體的檢出率。

本研究中，42例患者支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測結果陽性，病原體種類分別為：細菌56株、真菌14株、病毒32株、沙眼衣原體1株；17例患者傳統培養檢測結果陽性，其中共檢測到病原體24株，均為細菌；可見對病毒、真菌、細菌、特殊的病原體的檢測中支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測的陽性率遠遠高于傳統培養，與既往支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測應用于病毒、真菌、細菌、特殊的病原體等方面的相關報道一致[9-12]。

本研究中，支氣管肺泡灌洗液mNGS與傳統培養在病原體檢測結果的一致性比較中，2例檢測到的病原體一致，主要為肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌；13例檢測到的病原體不一致，在檢測結果不一致的例數中通過不同的檢測方法檢測到的病原學分布情況(見表5)，可見：在肺炎鏈球菌的檢出中痰培養比支氣管肺泡灌洗液培養檢出率高，而對卡他莫拉菌的檢出中痰培養比支氣管肺泡灌洗液培養及支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測的檢出率高，在流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌的檢出中支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測比傳統培養檢出率高，在金黃色葡萄球菌的檢出中支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測和灌洗液培養比痰培養檢出率高，支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測比傳統培養檢測到的病原體種類多，同時傳統培養可能培養出不確定具體病原體而只能確定種類的情況，足以顯示其局限性。27例傳統培養檢測陰性但支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測陽性，可見在傳統培養無法檢測到的病原體中，支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測具有較高的臨床價值。另外有1例傳統培養檢測陽性而支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測陰性，有3例支氣管肺泡灌洗液mNGS及傳統培養結果均為陰性，分析灌洗液mNGS檢測陰性可能的原因：(1)標本確實無相應病原體感染；(2)由于標本為支氣管肺泡灌洗液，故支氣管鏡操作者的技術可能會對檢測結果有所影響，需要提高支氣管鏡操作者的技術水平；(3)檢測儀器本身對一些特殊的病原體無敏感性或檢出率很低，故需進一步改進儀器；(4)由于我院的支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測最終都是送到院外檢測機構，這就延長了送檢時間，對支氣管肺泡灌洗液mNGS的檢測結果有影響。

表5 檢測結果不一致的例數通過不同的方法檢測到的病原學分布

本研究中，通過對臨床資料的分析，比較不同特征患者支氣管肺泡灌洗液mNGS陽性檢出率，發現性別、年齡、臨床癥狀、行mNGS檢測前住院天數、行mNGS檢測前使用丙球、行mNGS檢測前使用抗生素、實驗室檢查等均無統計學意義，而僅影像學提示肺炎、PCT有統計學意義，其中影像學提示肺炎比影像學提示無肺炎的檢出率更高(95.2%對50.0%)，可進一步表明支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測對重癥或難治性兒童肺部感染病原學檢出有較高的臨床應用價值。但由于本研究的樣本量較少，仍需要較大的樣本量進一步研究驗證，且本研究的PCT的特征中大部分為PCT≤0.5，故可進一步研究PCT與支氣管肺泡灌洗液mNGS陽性檢出率的關系及影響。

結 論

綜上所述，在支氣管肺泡灌洗液中使用mNGS檢測可以提高重癥或難治性的兒童肺部感染病原體的檢出率，尤其是在真菌、病毒和特殊的病原體方面。在傳統培養不能檢測到病原體的患者中，支氣管肺泡灌洗液mNGS可作為一種有效的檢測方法，指導臨床藥物的應用，提高治療效果，減少死亡率。所以，支氣管肺泡灌洗液mNGS檢測在我國重癥或難治性的兒童肺部感染的臨床診斷和治療中具有較高的臨床應用價值。