TNFR-Fc對急性肺損傷炎癥失衡中MAPK通路的影響

袁偉鋒 李理 黃文杰 鄭燕列

前期研究中已發現炎癥反應失衡是導致急性肺損傷(Acute Lung Injury，ALI)免疫損傷的重要因素。腫瘤壞死因子受體Fc段融合蛋白(Tumor Necrosis Factor Receptor-Fc Fusion Protein, TNFR-Fc)可結合血液中TNF-α而中斷TNF-α/NF-κB形成的炎癥反應正反饋環路[1]。除了典型的NF-κB信號通路，絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK)通路參與炎癥反應失衡的過程。

本研究采用氣管內滴入脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)LPS復制ALI小鼠模型，以TNFR-Fc中和外周血過量的TNF-α，通過Western Blot檢測MAPK磷酸化程度，qRT-PCR檢測TNF-α與NF-κB基因轉錄強度，ELISA法檢測氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar Lavage Fluid，BALF)/血清中白細胞介素1β(Interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、IL-10與干擾素γ(Interferon γ，IFN-γ)濃度，評價中和TNF-α對ALI過程中MAPK信號通路活化程度的影響。

資料與方法

一、材料

1 實驗動物

8周齡SPF級BALB/c小鼠24只，雌雄各半，體重18～22g，廣東省醫學實驗動物中心提供。小鼠在進行實前均自由進食。實驗經動物倫理委員會批準(SYXK2019-0100)。

2 藥物及主要試劑

LPS(E.coli O55:B5，Sigma公司)，TNFR-Fc(上海中信國健藥業有限公司)，ELISA試劑盒(武漢博士德公司)，TRIzol Reagent(TaKaRa)，RT-PCR試劑盒(TaKaRa)，RIPA裂解液(武漢博士德公司)，細胞外調節蛋白激酶(Extracellular Regulated protein Kinases，Erk1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinases，JNK)及相應的磷酸化抗體(Cell Signaling Technology)。

二、方法

1 小鼠的分組與ALI模型復制

24只小鼠隨機平均分為LPS組與TNFR-Fc+LPS組。兩組小鼠均通過氣管內滴入LPS(5mg/kg)復制ALI模型。此外，TNFR-Fc+LPS組小鼠在氣道內滴入LPS前24小時腹腔內注射TNFR-Fc(0.4mg/Kg體重)。兩組小鼠于LPS滴入即時(表示為0h)與滴入后2h處死并收集BALF、血清與組織樣本。

2 ELISA法檢測血清及BALF中炎癥因子濃度

小鼠麻醉后分離并暴露腹主動脈，取全血，5000轉/分離心10min，收集血清置4℃保存備測；暴露氣管，向心端插入套管針，以注射器抽取4℃磷酸緩沖鹽溶液肺內灌洗收集BALF；ELISA法檢測血清與BALF中IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ濃度，檢測方法按相應試劑盒說明書進行。

3 RT-PCR檢測TNF-α與NF-κB基因轉錄強度

冷生理鹽水氣管肺泡灌洗與右心室穿刺沖洗，去除肺內及血管內游離細胞。分離全肺，清除組織表面殘血，勻漿提取總RNA，調整RNA濃度為500ng/μL備測。采用PrimerPremier5.0軟件設計TNF-α與NF-κB基因的引物。TNF-α引物上游5′-CACATTCAGATCCCGAAACGC-3′，下游5′-CAATCCACAACTCGCTCCAAGA-3′；NF-κB引物上游5′-TGGCATCCCTTCACTCTGA-3′，下游5′-GGCACGCTGGAATTTGTAC-3′；β-actin引物上游5′-AGGGAAATCGTGCGTGACATCAAA-3′，下游5′-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3′。按SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit II說明書兩步法進行RT-PCR反應，同時擴增β-actin，以β-actin為基準進行相對定量。

4 Western Blot檢測MAPK磷酸化水平

取小鼠抽提總蛋白，測定各樣本蛋白濃度并校正各樣本間濃度差異。蛋白電泳后轉膜，分別以磷酸化Erk1/2、p38、JNK單抗孵育，洗膜后二抗孵育，化學發光法檢測各磷酸化Erk1/2、p38、JNK含量。使用抗體洗脫液洗脫磷酸化抗體后，分別再以Erk1/2、p38、JNK單抗孵育，洗膜后二抗孵育，化學發光法檢測Erk1/2、p38、JNK含量。計算磷酸化目標蛋白與總目標蛋白OD值比值。

三、統計學處理

采用IBM SPSS 20軟件進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，資料滿足正態性時采用t檢驗，不滿足時采用t′檢驗。檢驗水準為0.05。

結 果

一、血清及BALF中炎癥因子濃度

兩組小鼠在氣管內滴入LPS后2小時血清IL-6與IL-10濃度均較0小時顯著增高；在滴入LPS后2小時，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-6濃度顯著低于LPS組(P=0.018)，IL-10濃度增高，但二組差異無統計學意義(P=0.763)(見表1)。

表1 兩組小鼠血清炎癥因子濃度比較(n=12)

兩組小鼠在氣管內滴入LPS后2小時BALF中IL-6濃度較0小時顯著增高；在滴入LPS后2小時，TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-6濃度顯著低于LPS組(P=0.002)，IL-10濃度增高，但二組差異無統計學意義(P=0.190)(見表2)。

表2 兩組小鼠BALF炎癥因子濃度比較(n=12)

二、肺組織TNF-α與NF-κB基因轉錄強度

兩組小鼠在氣管內滴入LPS后2小時肺組織TNF-α與NF-κB基因轉錄強度均較0小時顯著增高；在滴入LPS后2小時，TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織TNF-α基因轉錄強度顯著低于LPS組(P=0.006)，NF-κB基因轉錄強度下降，但二組差異無統計學意義(P=0.061)(見表3)。

表3 肺組織TNF-α與NF-κB基因轉錄強度比較(n=12)

三、MAPK磷酸化水平

LPS組小鼠在氣管內滴入LPS后2小時肺組織Erk1/2、p38與JNK磷酸化水平較0小時均顯著增高；TNFR-Fc+LPS組小鼠僅p38與JNK磷酸化水平顯著增高。在滴入LPS后2小時，兩組小鼠TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織Erk1/2、p38與JNK磷酸化水平顯著低于LPS組(P=0.001；P=0.010；P=0.002)。見表4。

表4 肺組織MAPKs磷酸化水平變化(n=12)

討 論

一般情況，機體內促炎反應與抑炎反應維持平衡，致炎因素促進TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8等促炎細胞因子表達并引起全身炎癥反應；同時機體內合成與分泌內源性抗炎介質IL-10、IL-11、IL-13以對抗炎癥反應的放大，防止全身炎癥反應引起機體自身組織的破壞[2,3]。在ALI發病過程中可觀察到上述平衡被打破，表現為炎癥信號反應通路不受抑制地過度激活[4]。

IL-6是典型的促炎細胞因子，能誘導多種急性期蛋白的合成[5]。血清IL-6水平可作為判斷嚴重感染預后的指標[6]。在本研究中，小鼠在氣管滴入LPS后BALF與血清IL-6濃度均顯著升高，而TNFR-Fc預處理，能有效地降低IL-6濃度，提示中和TNF-α有利于下調炎癥反應。IL-1β是另一個促炎細胞因子，與感染性休克發生與死亡密切相關[7]。本研究中三組小鼠外周血與BALF中IL-1β濃度相仿，而在本研究組其他相關研究及國內其他團隊的研究中發現IL-1β僅在單次LPS刺激的早期表達[8]，以1小時達峰值，后期迅速下降，在2小時已恢復至刺激前水平。IFN-γ在細菌感染引起的炎癥反應中起一定作用，但主要參與病毒感染引起的免疫應答。本研究采用LPS模擬革蘭陰性菌感染所致的炎癥失衡，故未發現IFN-γ在三組小鼠中出現明顯表達差異。。在IL-6、IL-1β等促炎細胞因子表達的同時，IL-10也隨之表達[9]。IL-10能下調Th1細胞與巨噬細胞等炎癥細胞活性，控制炎癥過度放大及減輕其對機體正常組織細胞的損傷[10-12]。在本研究中，ALI小鼠在LPS處理后，BALF與血清IL-10濃度顯著升高以平衡過度的炎癥反應，研究也發現TNFR-Fc處理并未顯著影響IL-10濃度，說明中和TNF-α并未影響機體炎癥抑制反應，有助于恢復炎癥平衡。

TNF-α與NF-κB構成炎癥反應信號通路正反饋放大環路的核心，中斷二者均有效降低炎癥反應信號強度[13-14]。TNF-α結合TNFR發揮其生理活性，降低外周血TNF-α或阻斷TNF-α與TNFR結合均可抑制其誘發的炎癥信號。TNFR-Fc是TNFR的膜外區與IgG的Fc段形成的融合蛋白，TNFR的膜外區與TNF-α結合既有效降低外周血游離TNF-α濃度，也阻斷TNF-α與炎癥反細胞表面TNFR的結合，降低TNF-α/NF-κB二者形成炎癥反應正反饋放大環路。本研究發現肺組織內TNF-α基因表達在中和TNF-α后顯著下調，說明中和TNF-α能中斷TNF-α再釋放引起的炎癥反應二次放大。本研究通過TNFR-Fc中和ALI小鼠血清游離TNF-α后，NF-κB基因轉錄強度下降，但未達到統計學差異，說明中和TNF-α下調炎癥更依賴于轉錄因子的活化而非基因轉錄。

細胞接受刺激信號后，MAPKs發生磷酸化而活化[15]。MAPK信號轉導通路最具代表性的是Erk1/2通路、p38通路與JNK通路。Erk1/2活性與肺上皮細胞的NF-κB活化密切相關，抑制Erk1/2磷酸化后NF-κB的轉錄調節作用將受明顯的抑制[16]。在本研究中，LPS引起肺組織Erk1/2、p38與JNK磷酸化水平升高，當給予TNFR-Fc預處理后，三者磷酸化水平均下調，其變化與炎癥反應變化趨勢一致，證實中和TNF-α能降低MAPKs磷酸化水平而降低肺組織炎癥反應強度。

綜上所述，TNFR-Fc中和TNF-α能下調炎癥反應信號通路中MAPKs磷酸化水平，中斷TNF-α介導的炎癥反應反饋放大，從而減少促炎細胞因子IL-6表達，但不明顯影響抑炎細胞因子IL-10表達，有助于下調炎癥反應強度，恢復ALI的促炎/抑炎反應平衡。