添加乳酸菌對營養期菊芋莖葉青貯發酵品質動態變化的影響

劉巧玲，趙芳芳，馬曉蕾，孫紅先，李杰，何兆華，梁雪，王小鳳，李少斌

(甘肅農業大學動物科學技術學院，甘肅農業大學甘肅省草食動物生物技術重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

隨著我國草食畜牧業的快速發展，粗飼料資源缺乏的問題日益突出。合理開發和高效利用農作物副產品，有助于農業生產的“節本增效”及產業結構的優化升級。菊芋(Helianthustuberosus)是一種菊科向日葵屬多年生草本植物，具有易種植、再生能力強、產量高等特點[1]。塊莖中富含菊芋多糖(約占干物質的70%)，是當前提取菊粉的最佳原料[2]；莖葉富含碳水化合物、粗蛋白質(Crude protein，CP)和礦物質，是一種較為優質的粗飼料，可以用來飼喂牛、羊等動物[3-5]。但由于菊芋莖葉表面覆蓋白色短糙毛(或剛毛)，直接飼喂適口性較差，且不易儲存，使得菊芋莖葉的飼料化利用程度較低，多被焚燒，造成資源浪費和環境污染。有研究發現青貯可以改善菊芋莖葉的飼喂價值，但受到品種、刈割時期和晾曬時間等的影響[6]。添加玉米秸稈和乳酸菌可以提高菊芋莖葉的青貯品質[7-8]。然而截至目前，添加乳酸菌對青貯菊芋莖葉發酵品質的動態影響規律及對養分消化率的影響報道較少。本研究以甘肅省種植范圍較廣且營養價值較高的定芋1號為試驗材料，采集不同營養期菊芋莖葉，測定干物質(Dry matter,DM)含量、水溶性碳水化合物(Water soluble carbohydrates,WSC)含量和緩沖能值(Buffer capacity,BC)，及常規營養成分，從中選取適合青貯的營養期菊芋莖葉原料，研究添加乳酸菌后不同發酵時期青貯菊芋莖葉的發酵品質和營養成分動態變化，以及乳酸菌對體外發酵和養分消化率的影響，掌握菊芋莖葉青貯發酵的動態規律及飼用價值，為合理開發利用菊芋莖葉資源及非常規飼料資源的飼料化利用提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

菊芋莖葉(定芋1號)購自蘭州市榆中縣，地理位置E 104°12′，N 35°49′；乳酸菌(乳酸菌活菌數≥3×109cfu/mL)購自大莊仕合源乳業有限公司。

1.2 試驗設計

分別采集現蕾期、盛花期和成熟期菊芋莖葉，測定WSC、BC和DM含量，篩選出適合制作青貯的營養期，采用單因素試驗設計，設2個處理組，分別為添加0.2%乳酸菌組(T)和不添加乳酸菌組(C)，每個處理15個重復。采用青貯發酵罐調制菊芋莖葉青貯飼料，分別在發酵1、7、15、30和60 d開封，每次各開封3個發酵罐，測定其發酵品質和營養成分。再篩選優質青貯菊芋莖葉，采用體外產氣法評定菊芋莖葉青貯飼料的營養價值。

1.3 青貯菊芋莖葉的調制

選取新鮮菊芋莖葉，距離地面3 cm處刈割(約80 kg)，迅速帶回實驗室，剪至1～2 cm，混勻，稱重，按照比例加入乳酸菌，裝入2 L發酵罐中，壓實，密封，置于室溫下(25～28 ℃)避光發酵。

1.4 體外產氣培養體系

根據Menke等[9]的方法配置人工唾液，將新鮮采集的瘤胃液(用瘤胃液采集器從口腔采集3只健康成年小尾寒羊瘤胃液，混合，4層紗布過濾至39 ℃預熱過的厭氧保溫瓶中，并通入CO2)與人工唾液按照1∶2體積混合，作為體外產氣培養液。準確稱取200 mg飼料樣品，加入體外產氣管中，邊通入CO2邊加入30 mL制備好的培養液，排出多余的氣體，密封，置于39 ℃恒溫水浴搖床上培養。

1.5 測定指標及方法

青貯發酵品質測定方法：青貯感官品質評定參照德國農業協會評分法(DLG)，即對氣味、結構、色澤等3項分別進行評分，然后將得分相加，總得分按優、可、中、下等進行感官評分(表1)；WSC含量測定：稱取1 g樣品，放入試管中，加15 mL的蒸餾水。水浴20 min，冷卻至室溫后，用漏斗過濾到25 mL的容量瓶中，最后沖洗殘渣數次并定容,采用蒽酮-硫酸比色法測定[10]；BC含量測定：于250 mL燒杯中加入2 g樣品(鮮樣20 g)，100 mL蒸餾水。邊攪拌(JB-3型磁力攪拌器，上海雷磁新涇儀器有限公司)邊測定pH值，記錄用0.1 mol/L NaOH調節溶液pH值從4.0至6.0所用毫升數，用蒸餾水做空白處理[11]；DM含量的測定參考楊勝[12]的方法；中性洗滌纖維(Neutraldetergentfiber,NDF)和酸性洗滌纖維(Aciddetergentfiber,ADF)采用Van Soest法[13]測定；pH測定方法[14]：取鮮樣20 g，加入180 mL蒸餾水，高速勻漿機攪碎1min，四層紗布和定性濾紙分別過濾后，制備為浸提液，用酸度計測定pH值，用馮宗慈[15]改進方法測定NH3-N含量，用氣相色譜儀測定VFA含量，用試劑盒(南京建成生物工程研究所)測定乳酸(Lactic acid,LA)含量。

表1 青貯飼料感官評定標準(DLG)

營養成分和瘤胃發酵體外產氣測定方法：體外產氣結束后，取下注射器，立即用酸度計(pHS-3C，上海雷磁儀器廠)測定pH值，離心，制備上清液，采用上述方法測定NH3-N含量，參考曹雨莉[16]等方法用氣相色譜儀(6890N，Agilent)測定揮發性脂肪酸(Volatile fatty acid，VFA)含量。

1.6 數據分析

試驗數據采用Excel進行初步整理統計，采用SPSS 26.0進行獨立樣本T檢驗分析，對組間發酵品質、常規營養成分、IVDMD等指標進行比較，分析結果用平均數±標準差表示，P<0.05作為差異顯著的判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同營養期菊芋莖葉的營養成分

菊芋莖葉原料從現蕾期、盛花期到成熟期DM、WSC、NDF和ADF含量以及BC均顯著增加(P<0.05)，而CP含量顯著降低(P<0.05)(表2)。在保證塊莖產量的基礎上，本試驗選取盛花期菊芋莖葉制備青貯飼料。

表2 不同營養期菊芋莖葉營養成分(干物質基礎)

2.2 添加乳酸菌對青貯菊芋莖葉感官品質的影響

C組第30天和第60天感官品質總評分13分，為2級；T組第30天和第60天感官品質總評分19分，為1級。添加乳酸菌可以提高菊芋莖葉青貯飼料的感官品質(表3)。

表3 添加乳酸菌對菊芋莖葉青貯飼料感官品質的影響

2.3 添加乳酸菌對菊芋莖葉青貯飼料發酵特性的影響

2.3.1 對pH和乳酸含量動態變化的影響 隨著發酵時間的延長，兩處理組pH值呈現下降趨勢，且除第1天T組顯著低于C組外(P<0.05)，其他天數內T組均極顯著低于C組(P<0.01)(圖1-A)。兩處理組的乳酸含量則隨發酵時間的延長呈現上升趨勢，且T組均極顯著高于C組(P<0.01)，發酵第60天時，T組較C組顯著提高了13.65%(圖1-B)。

圖1 菊芋莖葉青貯飼料pH值動態

2.3.2 對VFA含量動態變化的影響 C組和T組的乙酸、丁酸含量的動態變化趨勢均相似，隨著發酵時間的延長呈現上升趨勢。C組乙酸含量均極顯著高于T組(P<0.01)，且發酵60 d時，T組較C組降低了35.02%(圖2-A)；除第1天兩處理組丁酸含量差異不顯著外，其他時間C組丁酸含量均極顯著高于T組(P<0.01)，且發酵60 d時，T組較C組降低了30.00%(圖2-B)。

圖2 菊芋莖葉青貯飼料有機酸含量動態

2.3.3 對NH3-N含量動態變化的影響 C組和T組的NH3-N含量動態變化趨勢相似，隨著發酵時間的延長呈現上升趨勢。C組NH3-N含量均極顯著高于T組(P<0.01)，且發酵60 d時，T組較C組降低了11.19%；(圖3)。

2.4 添加乳酸菌對青貯菊芋莖葉營養成分的影響

2.4.1 對DM和WSC含量動態變化的影響 C組和T組的DM及WSC含量動態變化趨勢相似，隨著發酵時間的延長呈現下降趨勢。T組DM含量均極顯著高于C組(P<0.01)，且發酵60 d時，T組較C組增加了17.80%；T組WSC含量均極顯著高于C組(P<0.01)，且發酵60 d時，T組較C組增加了17.78%(圖4)。

圖4 菊芋莖葉青貯飼料DM和WSC含量動態

2.4.2 對NDF和ADF含量動態變化的影響 C組和T組的NDF和ADF含量動態變化趨勢相似，隨著發酵時間的延長無顯著性變化(P>0.05)。除第1天T組ADF含量極顯著高于C組外，其他時間內均極顯著低于C組(P<0.01)；除第1天、30天T組ADF含量極顯著低于C組外，其他時間內均極顯著高于C組(P<0.01)(圖5)。

圖5 菊芋莖葉青貯飼料NDF和ADF含量動態

2.5 菊芋莖葉青貯飼料中添加乳酸菌對體外發酵和干物質消化率的影響

與C組發酵(60 d)相比，T組發酵(60 d)可以顯著增加24 h總產氣量和干物質消化率(P<0.05)，顯著降低24 h NH3-N含量(P<0.05)，顯著降低12 h和24 h的pH值(P<0.05)，對其他時間點總產氣量、pH值、NH3-N含量和干物質消化率均無顯著影響(P>0.05)(表4)。

表4 綿羊瘤胃發酵和養分表觀消化率

3 討論

水分含量、可溶性碳水化物含量和緩沖能值是粗飼料青貯的關鍵指標。水分含量過高會導致養分隨水分滲出而流失，以及霉菌等有害菌的大量繁殖；過低則不利于壓實，使得好氧菌大量繁殖，降低青貯品質[17-18]。Buxton等[19]認為優質的青貯原料DM含量為 250～400 g/kg(鮮樣基礎)，WSC含量高于30 g/kg(DM基礎)，緩沖能值低于350 mEq/kg(DM基礎)。本試驗采集的盛花期菊芋莖葉DM含量為320.7 g/kg(鮮樣基礎)，WSC含量為22.60 g/kg(DM基礎)，緩沖能值為50.62 mEq BC/kg(DM基礎)，較適合制作青貯飼料。

添加乳酸菌可以提高青貯飼料的發酵品質。本研究發現添加乳酸菌可以顯著降低菊芋莖葉青貯飼料pH值、乙酸、丁酸、NH3-N含量，顯著增加乳酸含量、DM含量、WSC含量，表明添加乳酸菌可以提高菊芋莖葉青貯飼料品質。Xie等[20]等研究發現在苜蓿青貯飼料中添加乳酸菌可以顯著降低pH值、NH3-N含量和非蛋白氮含量，增加真蛋白氮含量。另外有研究發現添加乳酸菌可顯著增加青貯構樹葉的乳酸含量，降低乙酸含量[21]；還可以顯著增加辣木葉青貯飼料乳酸含量，降低乙酸和丙酸含量[22]。這些研究均與本試驗結果一致。此外，本研究還發現，添加乳酸菌對菊芋莖葉青貯飼料NDF含量和ADF含量無顯著影響。苗芳等[23]研究發現，添加異質性布氏乳酸菌可以顯著增加全株玉米青貯飼料NDF含量，對ADF含量無顯著影響；而添加復合(同質性+異質性)乳酸菌顯著降低NDF含量和ADF含量。這說明乳酸菌菌株類型影響微生物分解利用飼料中NDF和ADF。

青貯發酵是微生物生長繁殖和生物化學變化的過程。本研究發現，對照組和試驗組pH值、DM和WSC含量的動態變化趨勢相似，均表現出隨著發酵時間的延長，第7天顯著下降，之后趨緩，第60天最低；乙酸、丁酸、NH3-N和乳糖含量表現出隨著發酵時間的延長，第7天顯著增加，之后趨緩，第60天最高。本試驗結果與在多花黑麥草青貯飼料中添加不同濃度丙酸對VFA、乳酸和WSC以及pH的動態變化的影響[24]及華北駝絨藜青貯飼料中添加乳酸菌對pH、乙酸、丁酸、NH3-N和乳糖動態變化影響[25]，結果基本一致。此外，本研究發現，與對照組相比，添加乳酸菌第7、15、30和60天的pH值、NH3-N、乙酸、丁酸、含量均顯著降低，DM和WSC和乳糖含量顯著增加。這是由于添加乳酸菌可以使青貯飼料中的乳酸菌快速大量增值，降低pH值，抑制有害菌的生長繁殖，縮短好氧發酵過程，既減少營養物質的損失，又提高了菊芋莖葉的青貯品質[26-28]。

體外產氣法是評價飼料營養價值的常用方法，操作簡單，與動物試驗結果有較強的相關性[29]。本研究發現，添加乳酸菌可以顯著增加體外24 h總產氣量和干物質消化率，并顯著降低pH值和NH3-N含量，對48 h總產氣量、pH值、NH3-N和干物質消化率無顯著影響。Xie等[20]研究發現添加乳酸菌可以顯著增加24 h總產氣量，對48 h干物質消化率和NH3-N含量影響不顯著，與本試驗結果一致。

4 結論

添加乳酸菌可顯著降低菊芋莖葉青貯飼料pH值、乙酸、丁酸、NH3-N含量以及體外發酵NH3-N含量、12和24 h的瘤胃液pH值，顯著增加乳酸含量、DM含量、WSC含量以及體外24 h總產氣量和IVDMD，提高感官品質，而對NDF、ADF含量無顯著影響，即添加乳酸菌可以提高菊芋莖葉青貯飼料的發酵品質和營養價值。