利用宏基因組高通量測序技術揭示血液病患者的感染譜

龐如利，吳梅青，石澤延，林雨，粟燕云，周寶文，白子文，趙衛華

感染是血液病患者常見的并發癥和死亡原因，研究發現引起血液病患者感染的原因一方面是由于患者接受化療等治療引起中性粒細胞減少，另一方面是由于多種侵入性操作和輸血等[1-3]。因此，早期檢測引起感染的病原微生物對改善血液病患者的預后尤為重要。傳統的病原微生物檢測方法，以培養法為代表，培養周期過長、且容易受抗生素的影響，不利于臨床快速診斷和治療[4]。隨著檢測技術的進步，近年來出現的宏基因組高通量測序（mNGs）技術在臨床中得到越來越多的應用。mNGs技術具有操作簡單、所需樣本量小、檢測快、不易受污染、可檢測出培養法不能檢測的邊緣微生物的優點[4]。本研究回顧性分析2018年8月至2020年12月廣西醫科大學第一附屬醫院血液科利用mNGs技術檢測有或疑似有感染癥狀患者的數據，明確患者的感染譜，以探討該技術在血液病患者感染的早期診斷及治療中的意義。

本研究主要發現：

（1）本研究利用宏基因組高通量測序（mNGs）技術揭示了血液學患者的感染譜，革蘭陽性菌中最常見的為痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌，革蘭陰性菌中最常見的為約翰遜不動桿菌、越南伯克霍爾德菌、烏汶克霍爾德菌，真菌中最常見的為限制性馬拉色菌；病毒中最常見的為巨細胞病毒、EB病毒、細環病毒。（2）mNGs技術與其他傳統檢測方法相比，具有高敏感性，可檢出更多病原體，且檢測時間快，對臨床盡早確定感染病因，調整用藥方案具有重要參考意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 標本來源于2018年8月至2020年12月廣西醫科大學第一附屬醫院血液科住院期間出現感染或疑似感染癥狀的53例血液病患者，對53例患者的58個樣本（全血、腦脊液、胸腔積液、組織、腹腔引流液、關節液、痰液、右下肢穿刺液）進行mNGs技術檢測。樣本送檢前有50個樣本的患者（包括45例患者，其中5例患者在不同的時間段送檢2次）有不同程度的發熱，伴隨癥狀有頭暈、頭痛、嗜睡、咳嗽、咳痰、咽痛、胸悶、胸痛、氣促等，其中進行影像學檢查的45個樣本中出現胸部、腹部或腦部影像學改變有34個（包括32例患者，其中2例患者在不同的時間段送檢2次）；8個樣本的患者（8例患者）無發熱，其中7個樣本的患者僅表現為胸悶、氣促、抽搐等疑似感染癥狀，1個樣本的患者無明顯癥狀，有7例患者出現胸部、腦部或關節影像學改變。此外，標本送檢前54個樣本的患者采用經驗性抗菌、抗真菌或抗病毒藥物治療1～69 d，相關報道指出mNGs技術檢測結果受抗生素的影響較小[5]。

1.2 方法

1.2.1 mNGs技術 采用3種mNGs技術檢測方法，分別為PMseqTM、PDC-seqTM、IDseqTM 。3種方法基于高通量測序技術對樣本中微生物核酸序列進行分析，通過與數據庫中已有微生物的核酸序列進行比對鑒定微生物。檢測過程：不同標本分別冷鏈送至華大基因公司（49個標本）、杰毅基因公司（5個標本）、微遠基因公司（4個標本）。對送檢的樣本進行處理、提取核酸（DNA和/或RNA）。對于核酸含量符合要求的樣本分別進行PMseqTM文庫構建、PDC-seqTM文庫構建、IDseqTM文庫構建，然后進行mNGs，去除測序的接頭及低質量和低復雜區域的序列后，利用計算宿主減法濾過人類基因組數據[6]，將處理后的非人類測序讀數與所構建的文庫進行匹配，最后取得可疑致病微生物的種類及相對豐度信息，從標本送檢至結果報告僅需2～3個工作日。

1.2.2 其他方法 在進行mNGs技術檢測的同時，52例患者（55個樣本）采用培養法檢測致病微生物、46例患者（50個樣本）采用G/GM試驗檢測致病微生物、44例患者（48個樣本）采用PCR檢測致病微生物。

1.3 統計學方法 采用sPss 26.0軟件進行數據分析。計數資料以相對數表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者資料及送檢情況 53例患者中男36例，女17例；年齡4～67歲，中位年齡18歲；重型地中海貧血23例，白血病17例，淋巴瘤4例，多發性骨髓瘤3例，地中海貧血合并白血病1例，重型再生障礙性貧血1例，骨髓增生異常綜合征1例，白細胞、血小板計數升高查因1例，全血細胞減少查因1例，發熱查因1例。53例患者中有5例患者送檢2次，其中在8個月內、4個月內、2個月內送檢2次的各有1例，在1個月內送檢2次的有2例。所送檢的58個樣本類型為全血（42個）、腦脊液（4個）、胸腔積液（4個）、組織（3個）、腹腔引流液（1個）、關節液（1個）、痰液（1個）、右下肢穿刺液（1個）。送檢前白細胞計數：33個樣本＜4×109/L，19個樣本為（4～10）×109/L，6個樣本＞10×109/L；送檢前中性粒細胞計數：16個樣本＜0.5×109/L，10個樣本為（0.5～2.0）×109/L，32個樣本 ＞2.0×109/L。

2.2 mNGs技術檢測血液病患者的感染譜 對58個樣本進行mNGs，57個樣本檢出可疑病原體（占98.3%），1個樣本無病原體檢出，且其他檢測方法亦為陰性，所檢測樣本的結果見圖1。

圖1 mNGs技術檢測的血液病患者的感染譜Figure 1 Bacterial and viral pathogen spectra of infections in patients with hematological diseases detected by use of mNGs technology

2.2.1 細菌感染譜 共檢測出革蘭陽性菌153例次，含25種細菌，前3位分別為痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、人葡萄球菌（分別為42、33、32例次，平均序列分別為187、117、240），見表1。共檢測出革蘭陰性菌202例次，含47種細菌，常見的為約翰遜不動桿菌、越南伯克霍爾德菌、烏汶克霍爾德菌（分別為26、20、19例次，平均序列分別為249、4 582、238），見表2。

表1 測序陽性的革蘭陽性菌分布情況〔n（%）〕Table 1 The distribution of Gram-positive bacteria detected by use of mNGs technology

表2 測序陽性的革蘭陰性菌分布〔n（%）〕Table 2 The distribution of Gram-negative bacteria detected by use of mNGs technology

2.2.2 真菌感染譜 共檢出真菌40例次，含12種真菌，其中以限制性馬拉色菌最常見（28例次，平均序列為69），見表3。

表3 測序陽性真菌分布 〔n（%）〕Table 3 The distribution of fungi species detected by use of mNGs technology

2.2.3 病毒感染譜 病毒檢測范圍僅限于常見DNA病毒，共檢出病毒97例次，含22種病毒，其中常見的為巨細胞病毒（CMV）、各型細環病毒、EB病毒（分別為26、19、13例次，平均序列分別為595、23、307），見表4。其他病原微生物感染譜：1例重型地中海貧血造血干細胞移植后患者血液及腦脊液樣本中均檢出剛地弓形蟲（序列分別為151、34 183）。

表4 測序陽性病毒種類分布〔n（%）〕Table 4 The distribution of viral species detected by use of mNGs technology

2.3 mNGs技術與其他檢測方法的檢測結果比較及指導治療情況 選擇同時進行mNGs技術檢測、培養法、G/GM試驗、PCR檢測的38個樣本進行分析。mNGs技術與培養法、G/GM試驗、PCR檢測病原微生物陽性率比較，差異有統計學意義（χ2=64.504，P＜0.001）；mNGs技術檢測病原微生物陽性率高于培養法、G/GM試驗、PCR檢測，差異有統計學意義（χ2=44.333、P＜0.001，χ2=37.255、P＜0.001，χ2=52.356、P＜0.001），見表5。mNGs技術與其他檢測方法同時檢測出相同病原微生物的有14個樣本，樣本陽性一致率為36.8%，檢出的相同病原微生物為CMV、EB病毒、嗜麥芽窄食單胞菌、限制性馬拉色菌、曲霉菌屬、白色念珠菌、阿薩西毛孢子菌。mNGs技術未檢出相關病原微生物但其他檢測方法檢出的樣本數為8個，概率為21.0%，相關病原微生物包括嗜麥芽窄食單胞菌、EB病毒、鮑曼不動桿菌、肺炎克雷伯菌、產酸克雷伯菌。此外，根據mNGs技術檢測結果調整用藥的有6例患者，其中4例患者經治療好轉，2例患者治療效果欠佳，治療效果欠佳患者系多重感染且免疫力低下，見表6。達70%[11]。以上研究說明血液病患者極易發生感染，及時檢測出引發感染的病原微生物對于正確使用抗感染藥物、快速控制感染及降低血液病患者死亡率具有重要

表5 mNGs技術與其他檢測方法的檢測結果比較Table 5 Detection results by use of mNGs technology and other three test methods

表6 根據mNGs技術檢測結果調整用藥情況Table 6 Medications adjusted for seven patients by the mNGs technology detection results

3 討論

惡性血液病患者由于受原發病的影響，免疫力低，傳統的化療藥物會導致其免疫力進一步受到影響，感染風險增加[7]。雖然近年來免疫抑制劑和小分子靶向藥物的使用改變了血液病患者的治療前景，但其與患者潛在的感染風險關系密切[8]。研究表明，感染是超過60%的血液系統惡性腫瘤患者的死亡原因，病原微生物感染所占比重從高到低依次為細菌感染、真菌感染、病毒感染[9]。有研究指出血液病患者和腫瘤患者血流感染的總死亡率為12.3%[10]。此外，也有研究表明血流感染是腫瘤患者30 d內死亡的影響因素，其死亡率為22%，若不能得到及時有效的抗感染治療，死亡率可高意義。傳統的病原微生物檢測方法雖然技術成熟，但存在檢測的病原微生物譜窄、不可檢測特殊病原微生物、花費時間長的局限，二代測序技術很好地彌補了傳統病原微生物檢測技術的缺點，其向臨床報告結果僅需2～3個工作日。本研究利用mNGs技術揭示了血液病患者的感染譜，下面就該感染譜的部分病原微生物展開討論。

既往研究表明，惡性血液病患者院內感染最常見的部位是呼吸道，最常見的病原菌是革蘭陰性菌[12-13]。本研究的細菌感染譜結果與上述結論一致，檢出的病原菌也以革蘭性陰性菌居多，但具體病原菌不盡相同，這主要歸因于檢測方法的不同，mNGs技術的檢測敏感性高，可檢測更多的機會性致病菌。本研究檢出的革蘭陽性菌中常見的葡萄球菌為表皮葡萄球菌和人葡萄球菌，均為機會性致病菌，人體免疫力下降時機會性致病葡萄球菌可能會引起感染癥狀。此外，由于近年來抗生素的廣泛使用，葡萄球菌多重耐藥有上升趨勢，一項研究指出人葡萄球菌及表皮葡萄球菌對青霉素耐藥率較高，分別為68.0%及90.9%[14]。故血液病患者出現感染癥狀并伴有葡萄球菌感染時，需根據臨床情況及時排查感染因素，謹慎處理。

本研究真菌感染譜中檢出率最高的為限制性馬拉色菌。限制性馬拉色菌是健康人皮膚的常駐優勢真菌[15]，也是一種條件致病菌。此外，本研究共檢出霉菌和酵母菌6例次（占15%），一項關于血液病患者真菌感染的研究顯示，血液病患者感染霉菌和酵母菌后的死亡率分別為70%和39%[16]，提示早期檢測出感染菌種有利于治療效果及預后。

一項對血液病患者造血干細胞移植后感染譜的研究顯示，病毒感染譜中檢出率最高的依次為CMV、EB病毒、細環病毒[17]。本研究病毒感染譜與之基本一致。另有研究顯示血液病患者發生CMV、EB病毒感染的風險高，且二者感染可降低患者免疫力，進一步加重感染風險[18]。此外，有研究指出細環病毒是免疫力的潛在標志物，可作為免疫力評估的補充[19-20]。

有研究表明中樞神經系統感染是血液病患者造血干細胞移植后的主要并發癥，弓形蟲感染是其主要病因[19-20]。而本研究中利用mNGs技術檢測1例重型地中海貧血造血干細胞移植后患者血液及腦脊液樣本中均發現剛地弓形蟲感染，為其治療方案提供了不可或缺的證據。

此前有研究指出mNGs技術比傳統培養法檢測陽性率更高，敏感性更高[21]，本研究結果與之一致。本研究利用mNGs技術對血液病患者樣本的檢測陽性率為98.3%，遠高于使用其他檢測方法（培養法、G/GM試驗、PCR檢測）的陽性率。mNGs技術的高敏感性對于血液病患者感染病因的尋找更加有利。但由于此法的高敏感性，樣本的污染菌也會被一并檢測出，故檢測結果會混淆臨床醫生對感染病因的準確判斷。只有在各個流程盡量避免樣本污染方可避免。此外，mNGs技術具有操作簡單、所需樣本量小、檢測快的優點，可使臨床工作者在最短時間內確定血液病患者感染病因，合理使用藥物控制感染，降低患者死亡率和改善患者預后，這與本研究根據mNGs技術檢測結果調整用藥的患者大多可控制感染的情況一致。本研究結果顯示，在同時進行4種檢測方法的38樣本中，mNGs技術未檢出相關病原菌但其他檢測方法檢出的樣本數為8個，說明mNGs技術有一定的假陰性率，故在進行mNGs技術檢測的同時，應同時進行培養法、G/GM試驗、PCR檢測以增加查找感染病因的準確度。本研究檢出的結果與全國多中心細菌培養結果不一致，主要歸因于本研究所用檢測方法的不同且患者數量有限。

綜上所述，mNGs技術比其他檢測技術對血液病患者感染病因的確定更具有優勢，但其可能出現假陽性和假陰性，結合其他檢測方法可降低錯誤診斷的機會。

作者貢獻：龐如利進行文章的構思和研究設計，結果的分析與解釋，負責撰寫論文；龐如利、趙衛華對文章整體負責，監督管理；吳梅青、石澤延、林雨負責資料收集與整理；粟燕云、周寶文、白子文負責數據處理與統計學分析、論文修訂與校正；趙衛華進行研究的實施與可行性分析，負責文章的質量控制。

本文無利益沖突。