中性脂肪沉積癥伴肌病患者的外周血細胞形態特點并文獻復習

邢瑩，普程偉，尚柯，屈晨雪

中性脂肪 沉 積 癥（neutral lipid storage disease，NLsD）是一種罕見的常染色體隱性遺傳病，主要由脂肪代謝途徑中的酶或輔基缺陷導致三酰甘油（triglyceride，TG）在不同組織細胞內異常沉積引起。依據臨床表現和突變基因不同可將NLsD 分為中性脂肪沉積癥伴肌病（neutral lipid storage disease with myopathy，NLsDM）和中性脂肪沉積癥伴魚鱗?。╪eutral lipid storage disease with ichthyosis，NLsDI）[1]。 前 者 是 由于 patatin樣磷酸酯酶結構域蛋白 2（patatin-like phospholipase domain-containing protein 2，PNPLA2）基因發生突變導致，主要臨床表現為骨骼肌或心肌損害癥狀[2]；后者的致病基因是比較基因識別 -58（comparative gene identification-58，CGI-58），又稱含α/β水解酶結構域蛋白5（α/βhydrolase domain-containing protein 5，ABHD5），主要臨床表現為魚鱗病，又稱為Dorfman-chanarin綜合征[3]。NLsD發病率低、臨床表現缺乏特異性、患者可就診于多個不同科室，部分患者伴有實驗室檢查結果異常如高脂血癥、高肌酸激酶（creatinine kinase，CK）、肝功能異常等，肌肉病理檢查可見肌纖維內大量脂肪沉積。但是以上檢查均不具有特異性，明確診斷仍有賴于基因檢測，很多患者因沒有及時進行基因檢測而延誤了診斷和治療。NLsD患者外周血涂片可見中性粒細胞胞質中存在大量空泡（瑞-姬氏染色），經油紅O染色證實為脂肪沉積有較高的診斷價值，但油紅O染色操作復雜，不適合常規實驗室開展。因此，本研究將3例NLsDM患者的外周血涂片采用多種方法進行染色，旨在找到更為便捷的染色方法，為NLsDM的及時診斷提供參考依據。

1 病例簡介

病例1，女性，36歲。因肌肉無力于2021年6月就診于北京大學第一醫院神經內科。患者雙上肢肌無力2年余，右側為著，雙上肢肌肉萎縮；無聽力下降及心功能下降；家族史：父母無近親結婚史，父母和弟弟均無類似癥狀；祖籍武漢；實驗室檢查：血清CK及TG水平升高；肌電圖（EMG）：雙上肢肌源性損害；肌肉活檢：可見脂質沉積；基因檢測：患者PNPLA2基因純合變異（c.757+1G＞T），家人未做基因檢測?；颊咴\斷為NLsDM，建議服用非諾貝特降低血脂以及中鏈脂肪酸飲食。

病例2，男性，27歲。8年前出現四肢無力，雙下肢近、遠端肌肉萎縮，且逐漸加重，目前行動困難；無聽力下降及心功能下降；未做肌電圖及肌肉活檢；于2021年7月就診于北京大學第一醫院神經內科。家族史：父母無近親結婚史、無類似癥狀，姐姐存在肌無力癥狀和聽力下降。實驗室檢查：血清TG和CK水平均增高?；驒z測：父母均存在PNPLA2基因雜合變異（c.757+1G＞T），患者和姐姐該位點存在純合變異，診斷為NLsDM，治療方案同病例1。

病例3，男性，38歲。5年前感覺雙腿易疲勞，上樓時無力，天冷時明顯；2年前出現雙耳聽力下降，雙腿無力加重，目前無法上樓；于2021年8月就診于北京大學第一醫院神經內科。家族史：父母近親結婚（奶奶和姥姥是親姐妹），無類似癥狀；哥哥患強直性脊柱炎，無聽力問題。實驗室檢查：血清TG和CK水平均增高?；驒z測：患者父母均存在PNPLA2基因雜合變異（c.703C＞T），患者該位點存在純合變異，診斷為NLsDM，治療方案同病例1。

本文價值：

（1）本文首次提出外周血細胞形態學檢查在及時診斷中性脂肪沉積癥伴肌?。∟LsDM）中的重要價值，以往的研究多集中于肌肉活檢、基因檢測等，但肌肉活檢為有創檢查，患者依從性差，而基因檢測尚沒有在臨床廣泛開展。外周血細胞形態學檢查操作方便，簡單易行，不需要額外檢測設備，在基層醫院均可開展，可作為篩查NLsDM的常規方法。（2）由于NLsDM非常罕見，本研究納入病例數較少，需要在今后的工作中繼續積累。

2 NLSDM患者外周血細胞形態特點

采用瑞-姬氏染色觀察患者外周血白細胞形態發現：中性粒細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞及單核細胞胞質中均可見數個大小不一的圓形空泡（圖1）。

圖1 NLsDM患者外周血白細胞形態（瑞-姬氏染色，×1 000）Figure 1 Morphology of peripheral blood leukocytes in NLsDM patients（Wright-Giemsa staining）

當人體存在細菌感染時，中性粒細胞胞質中亦可見空泡變性（圖2）。為了更好地與感染相鑒別，本研究進行了中性粒細胞堿性磷酸酶染色（NAP）、髓過氧化物酶染色（MPO）和糖原染色（PAs）。NAP（圖3）：根據中性粒細胞胞質中有無陽性顆粒及多少和分布情況分為（-）、（+）、（++）、（+++）和（++++），分別對應0～4分，100個細胞中陽性細胞總數為陽性率，陽性細胞積分之和為積分值[4]。NLsDM患者的中性粒細胞胞質中呈陰性反應，與正常人和感染患者差異明顯，感染患者陽性率和積分值均明顯增高；MPO（圖4）：NLsDM患者的中性粒細胞胞質中呈陽性反應，與正常人的中性粒細胞陽性程度接近，但弱于感染患者（陽性顆粒粗大覆蓋在細胞核上，導致細胞核結構不清）；PAs（圖5）：NLsDM患者、正常人及感染患者的中性粒細胞陽性反應程度均未見明顯差異。提示NAP可作為鑒別NLsDM與感染患者最佳的染色方法。

圖2 感染患者外周血白細胞形態（瑞-姬氏染色，×1 000）Figure 2 Morphology of peripheral blood leukocytes in infected patients（Wright-Giemsa staining）

圖3 NLsDM患者、正常人和感染患者的中性粒細胞（NAP，×1 000）（從左到右）Figure 3 Neutrophil of NLsDM patients，healthy individualsand infected patients（NAP staining）（from left to right）

圖4 NLsDM患者、正常人和感染患者的中性粒細胞（MPO，×1 000）（從左到右）Figure 4 Neutrophil of NLsDM patients，healthy individuals and infected patients（MPO staining）（from left to right）

圖5 NLsDM患者、正常人和感染患者的中性粒細胞（PAs，×1 000）（從左到右）Figure 5 Neutrophil of NLsDM patients，healthy individuals and infected patients（PAs staining）（from left to right）

3 討論

1953年JORDANs[5]在臨床表現為肌營養不良的兄弟二人中首次發現白細胞胞內脂肪滴。1966年，ROZENsZAJN等[6]在一對患者嚴重先天性魚鱗病的姐妹外周血白細胞中發現類似現象，并將之命名為Jordan's小體。1985年該疾病被命名為Chanarin-Dorfman綜合征，又稱NLsDI。2001年，LEFèVRE等[7]確認該病致病基因為CGI-58。NLsDM的發現相對較晚。1994年，WEssALOWsKI等[8]首次描述了1例表現為肌無力、肝腫大和高CK的4歲男性患兒，其肌細胞及外周血粒細胞內均可見脂肪滴沉積，患兒9歲的姐姐同樣存在高CK及粒細胞脂肪滴沉積，2人均無先天性魚鱗病癥狀，當時認為是臨床表型較輕的變異型NLsDI。2007年，FIsCHER等[9]報道了首例經基因檢測證實的NLsDM病例；陳涓涓等[10]于2009年報道了我國首例NLsDM病例。截至2020年，國內外累計報道經基因檢測證實的NLsDM病例70余例，但是國內尚未發現NLsDI病例[1]。

NLsDM患者男女比例無統計學差異，任何年齡均可發病，但多起始于成年人，進展緩慢，主要臨床表現為單純肌病、骨骼肌+心肌病及心肌血管病[11]，如肌無力、肌肉疼痛、活動后易疲勞及無癥狀性高CK血癥[12]。無癥狀高CK血癥患者年齡一般偏小，表明在短期內肌纖維中脂肪的蓄積并不影響肌肉的收縮功能[13]。30歲左右出現緩慢進展的肌無力癥狀，不對稱性肢體無力為其特點之一，且以右側肢體受累明顯。受累肌肉以承重?。ㄈ缂珉螏Ъ?、椎旁肌、大腿后部肌肉）較為突出，上肢重于下肢，近端重于遠端。除單純骨骼肌受累外，其他器官也可受累，一般無皮膚損害。心臟損害在NLsDM患者中較多見，一般晚于肌無力出現，表現為心悸、氣喘、易疲勞以及水腫、咳嗽、夜尿增多等心功能不全癥狀，也可出現心絞痛癥狀[14]。ZHANG等[15]進行的一項針對國內45例NLsDM患者的研究發現，患者表現為無癥狀CK增高2例、單純骨骼肌病18例、單純心肌病4例、骨骼肌和心肌同時受累21例；除此之外，患者可合并糖尿病、高脂血癥、胰腺炎、感音神經性耳聾等。MAssA等[16]進行的一項包含34例NLsDM患者的研究表明，患者除了存在骨骼肌受累外，還存在心肌損害（32%）、肝臟損害（23%）、糖尿病（23%）、身材矮?。?8%）、胰腺炎（15%）、神經性耳聾（9%）、甲狀腺功能減退（6%）以及認知障礙（3%）。

NLsDM患者中性粒細胞的形態異常與感染時的空泡變性較為相似，但是二者又存在明顯不同，主要表現為以下幾點：（1）中毒性改變的空泡變性只見于中性粒細胞，而NLsDM患者的中性粒細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞及單核細胞胞質中均可見空泡；（2）中毒性改變除可見空泡變性外，一般還伴有中性粒細胞的中毒顆粒、杜勒小體等其他形態學異常；（3）中毒性改變的空泡變性僅見于部分中性粒細胞，而NLsDM患者的絕大部分中性粒細胞胞質中均可見空泡，且空泡的形狀較圓、數量較多（1個細胞中可達10個以上）。通過以上形態學的差異，基本可區分NLsDM與感染時的空泡變性。但是，由于正常人外周血中的單核細胞、嗜酸粒細胞及嗜堿粒細胞的比例較低，特別在感染時會進一步降低，而且部分感染患者只有空泡變性，不伴有中毒顆粒等其他形態學異常，導致通過以上要點進行鑒別會比較困難。如果患者形態學特點不夠典型，可加做NAP染色。NLsDM患者中性粒細胞胞質中存在脂肪沉積，可能會影響其胞質中酶活性，因此NAP呈陰性反應；而感染患者胞質中酶活性明顯增強，陽性率和積分值均明顯增高。相比MPO和PAs，NAP能夠更好地將二者進行區分。

文獻報道NLsDM患者外周血和骨骼肌油紅O染色可見脂肪滴沉積，是篩查NLsDM的重要輔助手段[11]。但是，也有個別無脂肪沉積的病例[17-18]。而且，油紅O染色操作繁瑣、費時長，外周血中性粒細胞更不容易著色，經常出現假陰性。相比而言，外周血瑞-姬氏染色和NAP操作簡單，在臨床實驗室均可常規開展，更容易發現白細胞的形態異常。因此，對于臨床中發現的高CK血癥、隱匿起病的骨骼肌無力或有心肌損傷癥狀的患者，如果外周血白細胞出現上述典型的形態學特征，應考慮NLsDM的可能性，建議盡快完善PNPLA2基因檢測以明確診斷。

作者貢獻：邢瑩設計研究方案、負責論文起草；普程偉、尚柯負責進行實驗及圖片采集；屈晨雪負責最終版本修訂，對論文負責。

本文無利益沖突。