溫差和水分對黃連生物堿合成基因表達的影響

李君君，劉林秋，文家維，陳涵婷，何 洋

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué) 西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137; 2.四川省腫瘤醫(yī)院·研究所四川省癌癥防治中心臨床藥學(xué)部，四川 成都 610041)

0 引 言

黃連Coptis chinensisFranch.為毛茛科黃連屬，多年生草本植物，傳統(tǒng)中藥材，應(yīng)用歷史悠久，其主要藥用部位為根莖[1]。現(xiàn)代研究表明，生物堿類化合物為其主要有效成分，包括小檗堿、黃連堿、巴馬汀堿、藥根堿、非洲防已堿以及表小檗堿，其中小檗堿含量最高[2]。生物堿類化合物大多具有優(yōu)越的藥理活性，現(xiàn)已證實具有抗腫瘤、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗菌等藥理作用[3-4]，具有較高的醫(yī)用價值和經(jīng)濟價值。黃連在我國分布范圍較廣，四川、重慶、湖南、湖北以及陜西等地都有分布，但不同產(chǎn)地黃連的藥用成分含量存在差異，其臨床療效也存在差異[5]。中藥品質(zhì)是種質(zhì)遺傳、生態(tài)環(huán)境及藥材表型三者協(xié)調(diào)進化的結(jié)果，環(huán)境的變化也必然會導(dǎo)致遺傳與表型的改變，由此造成藥用成分含量及藥用品質(zhì)的改變，這也是藥材品質(zhì)差異區(qū)別所在[6]。因此，研究環(huán)境因子與遺傳因素相互作用對解析生物堿生物合成分子機制具有關(guān)鍵作用。

目前關(guān)于環(huán)境因子調(diào)控黃連中生物堿合成途徑關(guān)鍵基因表達的影響研究較少，對黃連的研究主要集中在化學(xué)成分分析、藥理作用機制，以及轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)黃連質(zhì)量形成關(guān)鍵基因[7-10]。此外，還有一些研究工作涉及到有效成分形成關(guān)鍵基因的克隆及其功能鑒定等方面[11-12]。通過我們前期進行的黃連潛在地理分布預(yù)測與化學(xué)成分分析，初步預(yù)測溫差和降水為影響黃連潛在分布以及生長適宜性的關(guān)鍵環(huán)境因子[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過環(huán)境脅迫結(jié)合關(guān)鍵基因表達分析，通過實時熒光定量PCR[14]分析不同晝夜溫差和水分下黃連生物堿合成途徑關(guān)鍵基因表達的變化，以探究晝夜溫差和水分缺失對黃連生物堿合成關(guān)鍵基因表達的影響，為進一步揭示生物堿合成的分子機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用的黃連植株（Coptis chinensisFranch.）材料來自于四川峨眉，選取長勢良好的黃連植株進行采樣。

1.2 晝夜溫差處理

選取生長狀況及規(guī)格一致的黃連植株分為A、B、C、D 4組，每組3株。D組為對照組，將其放入生化培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為 22 ℃。A、B、C 3組為實驗組，在 0～7 d 期間培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為 22 ℃，在8～14 d 設(shè)定培養(yǎng)箱溫度為 22 ℃（晝）/12 ℃（夜），15～21 d培養(yǎng)溫度為 22 ℃[15-17]，培養(yǎng)期間 A、B、C、D 4 組光照時間均為 12 h，光照強度為 3 000 lx。分別于第 7 d、14 d、21 d 各收集 4 組黃連樣品中一株植株，采集其根莖葉組織，用75%乙醇對收集組織樣品進行消毒，用無菌水沖洗祛除殘余乙醇，將處理好的組織樣品存放于液氮中，用于后續(xù)RNA提取。

1.3 水分脅迫處理

選擇生長狀況及規(guī)格一致的黃連植物分為A、B、C、D 4組，每組3株。D組為對照組，整個試驗期間每兩天澆一次水，使土壤水分含量維持在55%～65%；A、B、C 3組為實驗組，0～7 d每兩天澆一次水，8～14 d停止?jié)菜寥浪趾烤S持在35%～45%，15～21 d恢復(fù)澆水，定期測定各組土壤水分含量以確定澆水量，培養(yǎng)期間光照時間均為12 h，光照強度為 3 000 lx，分別于第 7 d、14 d、21 d 各收集4組黃連樣品中一株植株，采集其根莖葉組織[18-19]，收集的組織樣品處理方法同1.2。

1.4 關(guān)鍵基因選擇

根據(jù)已有文獻[20-21]以及課題組前期進行的黃連基因組測序和黃連有效成分代謝通路構(gòu)建工作，選擇黃連小檗堿下游生物合成途徑中的關(guān)鍵基因，包括可催化亞甲基二氧橋的形成的Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1，以及參與黃連多種生物堿合成途徑，可催化四氫化合物氧化的Cchi078208.m1和Cchi013467.m1，以黃連 18S rRNA（Genebank Accession No.DQ406855）為內(nèi)參，采用SYBR Green方法進行實時qRT-PCR，分析關(guān)鍵環(huán)境因子脅迫條件下其表達水平變化。

1.5 總RNA提取及cDNA合成

采用天根植物總RNA提取試劑盒（RNAprep Pure Plant Kit，目錄號：DP432），按照說明書提取黃連根、莖、葉樣品總RNA。RNA提取后用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，經(jīng)微量分光光度計檢測其純度和濃度，以檢測合格的總RNA為模板，采用TransScript? First-Strand cDNA Synthesis SuperMix試劑盒進行cDNA擴增。

1.6 熒光定量PCR

根據(jù)前期課題組黃連基因組測序得到目的基因序列，利用Prime 5.0設(shè)計PCR引物（表1）。采用全式金 TransStart? Green qPCR SuperMix 試劑盒進行qRT-PCR，反應(yīng)體系見表2。熒光定量采取三步法反應(yīng)程序，94 ℃ 變性 30 s；94 ℃ 反應(yīng) 5 s，退火15 s，72 ℃ 反應(yīng) 10 s，循環(huán) 40 次，收集熒光信號，并在循環(huán)結(jié)束后進行溶解曲線分析。每個樣品均進行三次重復(fù)。相對定量法分析實驗結(jié)果，計算2-ΔΔCt值。利用 Excel 2019 整理原始數(shù)據(jù)，GraphPad Prism 7.0 繪制圖形。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 晝夜溫差和水分缺失對黃連表型的影響

黃連適宜分布于溫帶濕潤季風(fēng)氣候地區(qū)，為其生長提供寒冷、濕潤和陰暗的環(huán)境條件，其生長的溫度范圍為 5～34 ℃，適宜生長溫度為 15～22 ℃[22]。已有研究表明溫度上下波動10 ℃足以對黃連產(chǎn)生傷害，并且黃連對高溫變化更為敏感[23]，具有耐低溫不耐高溫的習(xí)性，本文以黃連正常適宜溫度為基礎(chǔ)，最大化研究溫差對黃連生物堿合成基因表達的影響，將溫差控制在12～22 ℃。晝夜溫差和水分缺失對黃連表型的影響結(jié)果見圖1。如圖所示，在晝夜溫差 22 ℃（晝）/12 ℃（夜）處理后，部分黃連植株的葉片發(fā)生了不同程度的黃化，黃化的葉片呈淡綠色或淡黃色，黃化程度不高。黃連喜陰，更易在潮濕的環(huán)境中生長，水分缺失對黃連生長的影響較大，結(jié)果顯示，水分缺失處理之后，大部分黃連植株的葉片均發(fā)生了黃化，部分葉片的黃化程度較高，葉片呈深黃色或淺褐色，顯焦褐狀。

圖1 晝夜溫差（A）和水分缺失（B）條件下的黃連

2.2 熒光定量檢測體系的建立

本研究使用耶拿熒光定量儀進行PCR反應(yīng)。采用相對定量的方法檢測黃連生物堿生物合成途徑中 6個關(guān)鍵基因Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1、Cchi047990.m1、Cchi078208.m1和Cchi013467.m1，在不同脅迫條件下不同時間點黃連各部位的表達水平。黃連18S rRNA為內(nèi)參基因，以未經(jīng)脅迫處理，正常生長的黃連作為對照樣品。圖2為6對引物的溶解曲線，均為單峰，除目的基因外，無非特異性擴增，特異性較好，并且溶解溫度均在80 ℃左右，符合實驗要求。

圖2 引物溶解曲線圖

2.3 基因表達結(jié)果

對黃連生物堿生物合成途徑中具有重要功能的6個關(guān)鍵基因進行qRT-PCR分析，不同脅迫條件下不同時間點黃連各部位基因表達水平變化，以未經(jīng)脅迫處理的黃連作為對照樣品，采用相對定量法分析實驗結(jié)果，計算2-ΔΔCt值，進行統(tǒng)計分析。

圖3為溫差脅迫條件下黃連根（圖3A）、莖（圖3B）以及葉（圖3C）中各目的基因的表達情況，溫差脅迫以及正常處理條件下各目的基因在黃連不同組織部位的表達趨勢一致，表現(xiàn)為其表達量會隨著時間的推移而增加，說明黃連不同部位受溫差脅迫的影響一致。在溫差脅迫處理后，即14 d時，A、B、C 3個實驗組中黃連不同組織部位目的基因的表達量高于對照組，這說明晝夜溫差對黃連生物堿合成關(guān)鍵基因表達具有誘導(dǎo)作用，可對黃連生物堿合成進行正向調(diào)控，推測晝夜溫差可能通過誘導(dǎo)這關(guān)鍵基因表達而使小檗堿的合成和積累增加。

圖3 黃連溫差處理條件下根（A）、莖（B）、葉（C）中目的基因的相對表達量

圖4為水分脅迫下黃連根（圖4A）、莖（圖4B）以及葉（圖4C）中各目的基因的表達情況，結(jié)果如圖所示，水分缺失以及正常水分處理條件下各目的基因在黃連不同組織部位中的表達趨勢一致，這與溫差脅迫處理的結(jié)果類似。但與溫差處理條件下不同的是，在經(jīng)過水分缺失處理后，Cchi078208.m1和Cchi013467.m1基因表達量均高于正常澆水情況，在恢復(fù)澆水之后，其表達量反而減少，水分缺失對這兩個關(guān)鍵基因表達具有誘導(dǎo)作用。而目的基因Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1在黃連不同組織部位中其表達量均隨著時間的推移增加，但在經(jīng)過水分缺失處理后其表達量均顯著低于對照組。說明水分的缺失會增加催化四氫氧化物氧化的關(guān)鍵基因的表達量而使黃連有效成分的合成和積累增加，使催化亞甲基二氧橋關(guān)鍵基因的表達量降低而影響其小檗堿形成。

圖4 黃連水分缺失條件下根（A）、莖（B）、葉（C）中目的基因的相對表達量

3 結(jié)束語

本文通過晝夜溫差以及水分對黃連進行脅迫處理，利用qRT-PCR對經(jīng)過脅迫處理后的黃連樣品以及對照黃連樣品中關(guān)鍵基因的表達進行分析，分析關(guān)鍵環(huán)境因子對關(guān)鍵基因表達水平的影響。實驗結(jié)果顯示，在脅迫條件處理后，黃連各部位中關(guān)鍵基因的表達趨勢一致。晝夜溫差處理對關(guān)鍵基因具有直接特異誘導(dǎo)的作用，而水分的缺失可能會增加Cchi078208.m1和Cchi013467.m1的表達量，會使Cchi013261.m1、Cchi013263.m1、Cchi047971.m1和Cchi047990.m1的表達量降低。黃連中有效成分的形成經(jīng)多基因調(diào)控，關(guān)鍵環(huán)境因子對其生物堿生物合成途徑中關(guān)鍵基因具有不同的調(diào)控作用，從而影響黃連質(zhì)量形成，導(dǎo)致不同產(chǎn)地黃連藥材質(zhì)量差異。