盆腔惡性腫瘤患者放療后腸道菌群變化與放射性腸炎的相關性研究

朱小月，江柯煒，陳海嬌，朱琳，張婷，劉鵬飛，吳群英，王堅，殷華芳，沈衛東

(1.徐州醫科大學，江蘇 徐州 221000； 2.徐州醫科大學附屬江陰臨床學院，江蘇 江陰 214400)

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2020 年 10月至 2021 年 6 月徐州醫科大學附屬江陰臨床學院收治的首次接受放射治療的17例ⅠB～Ⅳ期盆腔惡性腫瘤患者，其中宮頸癌13例，子宮內膜癌4例。按照放射反應分級標準分為3組:0級(無癥狀組)患者6例，1級(輕癥組)患者5例，≥2級(重癥組)患者6例。納入標準：(1) 組織病理學確診宮頸癌或子宮內膜癌；(2) 根據《常見婦科惡性腫瘤診治指南(第 5 版)》接受規范放化治療[11]。排除標準：(1) 有嚴重的心、肝、腎等功能障礙；(2) 既往有腸道疾病及代謝性疾病，如直腸腫瘤、潰瘍性結腸炎、克隆病等腸道器質性疾病；(3) 嚴重急慢性感染性疾病；(4) 3級以上骨髓抑制。所有患者均首次接受盆腔放射治療，單次放射劑量為1.8 Gy,5次·周-1，放療總劑量40～50 Gy。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，所有操作均征得研究對象或其親屬的知情同意。

1.2 RE診斷分級標準

按照1995年美國放射腫瘤學協作組(Radiation Therapy Oncology Group，RTOG)和歐洲癌癥治療研究組織(European Organzation for Research and Treatment of Cancer，EORTC)[12]標準進行放射反應評級。將RE分為 0～5 級。0 級：無變化；1級：不需藥物處理的大便次數增加或習慣的改變，不需止痛藥的直腸不適；2級：需抗副交感神經藥的腹瀉，不需衛生紙的黏液排出或需止痛藥的直腸或腹痛；3級：需胃腸外營養支持的腹瀉，需衛生紙的出血、腹脹(X線平片證實擴張腸環)；4級：急性或亞急性腸梗阻、穿孔、竇管，需輸血的出血和需胃腸減壓或腸管改道的腹痛或里急后重。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集 前期臨床觀察及預實驗結果提示，在放療進程第3周及放療總劑量在20～30 Gy，患者臨床癥狀及血清學指標動態變化處于峰值平臺期。本研究分別在放療前、放療第3周采集患者清晨空腹靜脈血及糞便各1次。留取糞便標本2 g，使用專用保存管于-80℃冰箱保存。抽取靜脈血6 ml，以3 000 r·min-1離心10 min，取上層血清，-80 ℃保存備測。

1.3.2 腸道菌群檢測 采用16S rDNA測序及生物統計分析，對糞便樣品的基因組DNA進行提取，對微生物 16S rDNA 的高變區進行特異性擴增，根據所擴增的區域特點構建小片段文庫，并基于illumina NovaSeq測序平臺對文庫進行雙末端測序。使用QIIME2軟件中的DADA2方法進行拼接、去低質量、去嵌合體和降噪，從而獲得最終的ASVs(Amplicon Sequence Variants)。隨后對得到的有效數據進行序列分析以及物種注釋，收集樣本物種構成情況。α多樣性的評估：Chao1指數表示菌群豐度；Shannon指數、Simpson指數表示菌群多樣性。β多樣性的評估，采用非加權UniFrac距離NMDS(nonmetric multidimensional scaling)分析。物種差異分析及標志物種的尋找，采用LEfSe(LDAEffect Size)分析及Metastats分析[13]。檢測分析由北京諾禾致源科技股份有限公司代理完成。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 放療患者臨床特征與RE關系

本研究放療患者年齡、病理類型、臨床病理分期、腫塊大小、高血壓患病率等基線資料比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 放療患者臨床特征與RE發生關系

2.2 放療前、放療第3周血清及糞便中LPS、TN α、I 1β和HMGB1表達水平比較

表2 3組患者血清及糞便炎癥因子水平比較 pg·ml-1

2.3 腸道微生物菌群特征與RE嚴重程度的關系

2.3.1 盆腔惡性腫瘤患者放療前后腸道菌群α多樣性分析 放療前3組間Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數差異均無統計學意義(P>0.05)。與放療前相比，放療第3周重癥組和輕癥組Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數均較前下降，差異均有統計學意義(P<0.05)，無癥狀組放療前后Chao1指數、Shannon指數、Simpson指數差異均無統計學意義(P>0.05)。經協方差分析(以放療前數據為協變量)，3組間放療第3周Chao1指數、Shannon指數差異有統計學意義(P<0.05)，放療第3周重癥組和輕癥組Chao1指數低于無癥狀組，重癥組Shannon指數低于無癥狀組，差異均有統計學意義(P<0.05)。3組間放療第3周Simpson指數差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 腸道細菌群落α多樣性指數對比柱狀圖

2.3.2 盆腔惡性腫瘤患者放療前后腸道菌群β多樣性分析 采用非加權UniFrac距離NMDS(nonmetric multidimensional scaling)分析，對3組患者腸道細菌群落結構進行β多樣性顯著性分析，結果示組間差異具有統計學意義。放療前3組β多樣性比較存在較大差異(Stress=0.000 081，圖2A)；放療第3周3組間β多樣性差異也有所變化(Stress=0.042，圖2B)。

A.放療前；B.放療第3周。Stress<0.1說明結果可靠圖2 放療前及放療第3周組間基于非加權UniFrac距離NMDS β多樣性分析

2.3.3 腸道微生物之間物種差異分析及標志物種的尋找 尋找組間患者腸道微生物之間豐度差異較大的物種，通過LEfSe分析發現放療前無癥狀組Prevotellaceae科、Prevotella屬和Prevotella_copri種等豐度較高，輕癥組Mitochondria屬、Mitochondria科和Erysipelatoclostridium屬等豐度較高，重癥組Clostridium_methylpentosum_group屬和CAG_56屬等豐度較高。在經過3周放療，研究組樣本間的微生物差別也有所改變，從LEfSe來看，相比之下重癥組豐度更高的物種有Peptostreptococcaceae科、Peptostreptococcales_Tissierellales目和Romboutsia屬等。Metastate分析從門、綱、目、科、屬、種6個等級層面進一步尋找組間差別顯著性較大的物種，在種的水平上發現放療第3周重癥組較輕癥組及無癥狀組均顯著上調的物種Nitrospira_japonica(P值分別為0.021、0.003)。較放療前，重癥組患者第3周糞便中bacterium_TG160種顯著上調(P=0.006)，且明顯高于輕癥組(P=0.017)。另外，在放療前患者糞便中發現重癥組Castellaniella屬顯著高于輕癥組和無癥狀組(P值分別為0.021、0.022)。

2.4 相關性分析

表3 腸道菌群α多樣性指數與炎癥因子的相關性

3 討 論