CXCL1/2/10介導的免疫炎癥與草酸鈣結石形成的關系

劉文剛，張光遠，黎明，程祎，吳志榮，孔廣發(fā)，莫永軒

(1.東莞市濱海灣中心醫(yī)院 泌尿外科，廣東 東莞 523000; 2.東南大學附屬中大醫(yī)院 泌尿外科，江蘇 南京 210009)

近年來，隨著結石研究的不斷深入，免疫炎癥在草酸鈣結石形成過程中的作用機制被揭示。研究表明，在草酸鈣結石形成過程中，尤其是蘭德爾斑塊(Randall plaques,RPs)的形成過程中往往伴隨著免疫細胞的浸潤，不同免疫細胞比例的分布直接影響患者斑塊的形成與結石的發(fā)生[1]。Taguchi等[2]通過分析23例草酸鈣結石形成者(年齡和性別匹配)的腎乳頭和非乳頭旁邊組織及7例正常腎乳頭組織之間的基因表達發(fā)現，草酸鈣結石患者腎乳頭的骨橋蛋白、巨噬細胞(尤其是M1型巨噬細胞)及炎癥因子明顯升高或增多進而導致腎損傷和氧化應激加重，另外，組織炎癥細胞因子的表達會導致免疫細胞的數量和細胞凋亡水平均增加。這一研究結果表明炎癥細胞因子在草酸鈣結石形成過程中發(fā)揮了重要作用。本研究則基于GEO數據庫進行差異表達基因(DEGs)篩選，獲取草酸鈣結石危險因素之一，即特發(fā)性高鈣尿(idiopathic hypercalciuria，IH)SD大鼠mRNA數據，進行生物信息學分析，從中篩選關鍵分子并構建草酸鈣結石大鼠模型，并在大鼠腎組織中驗證關鍵基因的表達，為研究和干預草酸鈣結石形成提供新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2 生物信息學分析

1.2.1 數據下載與預處理 從NCBI基因數據庫中篩選出IH大鼠數據集(GES75542)進行后續(xù)分析。首先對GEO數據集進行預處理和歸一化，然后用Limma R軟件包進行DEGs分析。倍數變化(FC)>2和校正P值(Padj.)<0.05作為DEGs篩查的臨界值。

1.2.2 GO與KEGG功能富集分析 GO分析對基因進行簡單的注釋，具體分為3個方面，即細胞生物進程(biological process，BP)、細胞組成(cellular component，CC)及分子功能(molecular function，MF)。KEGG則可進一步獲得基因參與的主要功能和代謝通路。本研究利用Metascape(http:∥metascape.org/)數據庫[3]進行GO與KEGG功能富集分析，并對富集最顯著的前20位通路進行可視化分析。

1.3 構建草酸鈣結石大鼠模型

將20只SD雄性大鼠隨機分為兩組，即造模組(10只)和空白對照組(10只)。建模方法：第1周和第3周的前3天，灌胃1%氯化銨2 ml,且給予1%乙二醇飲用水飼喂。空白對照組：第1周和第3周的前3天，灌胃鹽水2 ml,并給予正常飲用水飼喂。4周后處死大鼠，并收集腎臟組織，進行切片染色等。

1.4 免疫組化實驗

按照免疫組化試劑盒說明書進行實驗，孵育不同抗體進行檢測，顯微鏡下觀察組織存在棕黃色或棕褐色則為表達陽性，顏色深淺程度反映蛋白表達水平的強弱。以 PBS 取代一抗為陰性對照，實驗結果評價由2名研究者單獨評分完成。

1.5 統計學處理

所有實驗均重復3次，數據以平均值±標準差來表示。采用 SPSS 16.0 統計軟件進行數據分析，兩組間差異采用t檢驗進行比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 GSE75542數據集篩選出195差異表達基因

首先將GSE75542測序數據以熱圖的形式進行展示(圖1A)，接著對數據進行預處理與歸一化，減少測序誤差(圖1B)；利用Limma R軟件包進行DEGs分析，共篩選出146個上調的基因，49個下調的基因(P<0.05, log2FC<-1或log2FC>1)(圖1C)。

A.GSE75542數據熱圖;B.數據集的預處理；C.DEGs的火山圖(P<0.05, log2FC<-1 或 log2FC>1)圖1 GSE75542數據集中篩選DEGs

2.2 功能富集分析及PPI蛋白互作篩選關鍵蛋白

在Metascapes數據庫中對195個DEGs進行GO與KEGG的功能富集分析，并將富集在前20位的通路進行可視化(圖2A)。結果顯示，基因富集在GO:0032496:對脂多糖的反應、GO:0010942：細胞死亡的正調控、GO:0002544:慢性炎癥反應、GO:0006954：炎癥反應、GO:0072593：活性氧代謝過程等代謝通路中；進一步分析各基因分布在具體通路中(圖2B)。對195個基因進行PPI蛋白互作分析結果(圖3A)顯示，score>20的基因共有10個，結合其基因功能，選定CXCL1、CXCL2、CXCL10、IL6、IL1B作為關鍵基因進行后續(xù)的實驗驗證(圖3B)。

圖2 DEGs的功能富集分析前20位(GO+KEGG)

圖3 DEGs的PPI分析圖(綠點：普通基因；紅點：score>20的 基因)

2.3 成功構建草酸鈣結石大鼠模型

HE染色結果顯示，造模組大鼠腎組織切片在顯微鏡下可以看到腎小管中存在大量的草酸鈣晶體沉積，且腎小管管腔變大，周邊腎組織結構紊亂(圖4A)；空白對照組大鼠腎組織無晶體沉積，且組織結構無變化(圖4B)。

圖4 大鼠腎組織HE染色圖

2.4 草酸鈣結石大鼠模型炎癥蛋白表達

與空白對照組比較，造膜組CXCL1/2/10明顯表達增高(P<0.001)，IL6與IL1B表達增高(P<0.05)。見圖5。

圖5 兩組大鼠腎組織免疫組化結果

3 討 論

綜上所述，本研究基于GEO數據庫篩選和生物信息學分析，并結合實驗驗證，最終篩選出CXCL1/2/10 3個在草酸鈣結石大鼠腎組織中明顯升高的免疫炎癥蛋白，為草酸鈣結石的后續(xù)機制研究與免疫干預提供了新的分子靶點，也為治療泌尿系結石提供一種新方向。