HPLC法同時測定益腎湯中7種成分的含量

程 偉，趙群濤，裘 罡，杜 瑞，尚慶霞

信陽市食品藥品檢驗所，信陽 464000

中藥湯劑是最常用的中藥復方劑型，也是中藥歷史上應用最久和最廣的制劑。從臨床療效來看，一般認為湯劑的療效優于其他制劑［1］。益腎湯是信陽市圣康醫院開發的常用方劑，療效顯著。本方由紅花、肉蓯蓉、當歸、丹參、淫羊藿、補骨脂等十余味中藥組成，具有益氣養陰、活血助陽的功效，用于氣陰兩虛、陽痿血瘀阻滯所致的面色無華或晦暗、少氣乏力、手足心熱、口干咽燥、腰脊酸痛、溺少浮腫、肢冷體麻等慢性腎炎證候者的治療。紅花在方中起活血通經、散瘀止痛的功效，大量研究發現，紅花主要含黃酮類、生物堿類、聚炔類等多種化學成分，紅花黃色素為紅花中的主要活性成分［2］。肉蓯蓉素有“沙漠人參”之美譽，其化學成分及特有的結構是肉蓯蓉發揮功效作用的物質基礎，如苯乙醇苷類中的松果菊苷、毛蕊花糖苷及多糖是抗氧化抗衰老、緩解疲勞等生物活性的物質基礎［3］。中高劑量的松果菊苷可以降低糖尿病腎病大鼠的血糖，抑制糖尿病腎病大鼠的腎間質纖維化和腎組織細胞凋亡，改善大鼠的腎功能［4］。研究表明，當歸中的有效化學成分在抑制微炎癥和慢性腎小球腎炎方面的效果明顯［5］。丹參及其提取物均被證實有良好的抗炎效果，丹參水提物和醇提物均顯示出良好的腎保護作用［6］。研究發現，淫羊藿苷可以改善腎臟組織學形態和功能，增加腎臟干、祖細胞數量和調節腎發育相關基因的表達，更能改善由氫化可的松誘導的大鼠腎陽不足證［7］。補骨脂中的呋喃香豆素類成分補骨脂素和異補骨脂素是其主要活性成分，在調節雌激素水平、抗腫瘤、抗氧化、抗菌、抗炎、抗抑郁、促進骨生長、保護神經等方面有多重活性［8］。本方法以方中6味藥材所含的主要成分羥基紅花黃色素A 等為指標成分，建立測定此藥7種活性成分的高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC），為控制該制劑的質量提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1200型高效液相色譜儀（G1314B VWD 可變波長紫外檢測器，安捷倫科技有限公司）；Mettler XS205型十萬分之一電子分析天平、TGW16型臺式高速離心機均購自長沙英泰儀器有限公司；德國普蘭德移液槍（1、5 m L）購自保定普倫商貿有限公司。

1.2 試藥

對照品：羥基紅花黃色素A（批號111637-201308，質 量 分 數 為96.5%），松 果 菊 苷（批 號111670-201505，質量分數為92.5%），阿魏酸（批號110773-201614，質量分數為99.0%），丹酚酸B（批號111592-201716，質量分數為94.1%），淫羊藿苷（批號110737-201516，質量分數為94.2%），補骨脂素（批號110739-201617，質量分數為99.7%），異補骨脂素（批號110738-201715，質量分數為99.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈（色譜純，美國天地公司）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

益腎湯由紅花、肉蓯蓉、當歸、丹參、淫羊藿、補骨脂、補骨脂、地龍、雞血藤、巴戟天、黃精、黨參、金櫻子、菟絲子組成，為本實驗室自制。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色 譜 柱：Sunniest C18（250 mm×4.6 mm，5μm）。流動相：乙腈（A）-1 m L·L－1磷酸水溶液（B）。梯度洗脫（0～5 min，14%A；5～30 min，14%A～34%A；30～40 min，34%A；40～45 min，34%A～14%A；45～55 min，14%A）。檢測波長：0～10 min為403 nm（檢測羥基紅花黃色素A），10～16 min為330 nm（檢測松果菊苷），16～22 min為320 nm（檢測阿魏酸），22～30 min為286 nm（檢測丹酚酸B），30～34 min為270 nm（檢測淫羊藿苷），34～50 min為246 nm（檢測補骨脂素與異補骨脂素）。流速：1.0 m L·min－1。柱溫：30℃；進樣量：5μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 樣品的制備 各味藥裝布袋加水浸泡30 min，置于煎藥機中加熱煎煮2次，第1次2 h，第2次1.5 h，合并煎液，靜置，沉淀，過濾，將濾液減壓濃縮至1 000 m L，加熱至沸，灌封，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補骨脂素與異補骨脂素7種對照品適量，加甲醇制成質量 濃 度 分 別 為436.18、577.94、455.00、683.92、639.05、489.73、451.73μg·m L－1的對照品儲備溶液，按照不同稀釋倍數配制成5個不同質量濃度的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取樣品1 m L，置于5 m L 具塞錐形瓶中，加甲醇至刻度，振搖后以15 000 r·min－1離心，上清液用0.45μm 微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

2.2.4 陰性樣品溶液的制備 按處方比例和制備工藝分別制備不含紅花、不含肉蓯蓉、不含當歸、不含丹參、不含淫羊藿、不含補骨脂的陰性樣品，再按照2.2.2項下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.3 專屬性考察

取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液、6 種陰性樣品溶液各5μL，按照2.1項下的色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果見圖1。由圖1 可知，供試品色譜圖中在與對照品色譜圖上相對應的位置有相同的色譜峰，且陰性樣品無干擾。

圖1 HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms

2.4 線性關系考察

依次精密吸取2.2.1項下的系列混合對照品溶液5μL注入高效液相色譜儀，按照2.1 項下的色譜條件進樣測定，記錄峰面積。分別以各成分的質量濃度（μg·m L－1）為橫坐標（x）、峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸，結果見表1。結果表明，7種成分在質量濃度范圍內與其峰面積線性關系良好。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.5 精密度實驗

精密吸取2.2.1 項下的同一混合對照品溶液5 μL，連續進樣6 次，按照2.1 項下色譜條件進行測定，記錄峰面積。計算得羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂 素 峰 面 積 的RSD 值 分 別 為0.94%、0.72%、1.02%、0.51%、1.10%、0.45%、0.68% （n＝6），表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性實驗

取同一供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣5μL，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。計算得羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素峰面積的RSD 值 分 別 為1.20%、0.98%、1.41%、1.52%、0.84%、1.05%、0.95%，表明在24 h內供試品溶液的穩定性良好。

2.7 重復性實驗

取同一批益腎湯（批號20210318），平行精密量取6份，每份1 m L，按照2.2.2項下供試品溶液處理方法制備供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的含量。計算得7種成分的含量平均值分別為35.7、234.5、45.2、138.1、50.6、49.1、45.0μg·mL－1，RSD值 分 別 為1.02%、1.13%、1.38%、0.85%、0.93%、0.62%、0.75% （n＝6），表明方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率實驗

取已知含量的益腎湯（批號20210318）樣品6份，每份精密量取0.5 m L，分別精密加入混合對照品溶液1 m L（羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的質量濃度 分 別 為17.45、115.59、22.75、68.39、25.56、24.49、22.59μg·m L－1），按照2.2.2項下供試品溶液處理方法制備加樣供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算各成分的回收率。計算得羥基紅花黃色素A、松果菊苷、阿魏酸、丹酚酸B、淫羊藿苷、補骨脂素和異補骨脂素的平均加樣回收率分別為99.20%（RSD＝0.61%）、96.25%（RSD＝2.63%）、98.53%（RSD＝1.18%）、96.98%（RSD＝2.10%）、96.90%（RSD＝1.81%）、98.78%（RSD＝1.09%）、98.65%（RSD＝1.00%）（n＝6）。

2.9 樣品的含量測定

取3批益腎湯，按照2.2.2項下供試品溶液處理方法制備供試品溶液，再按照2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，根據2.4項下得到的標準曲線方程計算各成分的含量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab.2 Results of content determination（n＝3）

3 討論

中藥湯劑是中醫臨床用藥最古老、最常用的劑型。《湯液本草》中有記載“湯者，蕩也，去大病用之”。在治療新冠肺炎的處方中，最常用的肺炎1號、清肺排毒湯等經臨床驗證有一定療效［9］，在新冠肺炎預防應用中，共檢索到預防方102條，其中主要采用水煎劑（69種）或代茶飲（26種）口服方式［10］。益腎湯應用于慢性腎炎證候者有較好的療效，前期曾用薄層色譜法對其個別成分進行定性鑒別，但由于中藥制劑配方復雜、成分較多，僅進行薄層鑒別難以保證質量的均一性和可靠性，故本研究對其制劑中的7種有效成分進行測定。

本實驗分別考察甲醇-1 m L·L－1磷酸溶液、乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液和乙腈-水3種不同流動相系統，結果表明，以乙腈-1 m L·L－1磷酸溶液作為流動相時，各成分峰形較好，且分離效果良好，分析效率更高，更節約檢測時間和成本。在選擇檢測波長參數方面，參考目標成分現有相關文獻［11-20］，按不同時間段設置波長參數：0～10 min為403 nm（檢測羥基紅花黃色素A），10～16 min為330 nm（檢測松果菊苷），16～22 min為320 nm（檢測阿魏酸），22～30 min為286 nm（檢測丹酚酸B），30～34 min為270 nm（檢測淫羊藿苷），34～50 min為246 nm（檢測補骨脂素與異補骨脂素），在此條件下各成分均有最大紫外吸收，以保證對各待測成分均能準確定量。本研究采用HPLC法快速測定該制劑中羥基紅花黃色素A 等7種中藥有效成分的含量，方法簡便、可靠，重復性好，結果準確，可為益腎湯的質量控制提供參考。