納布啡改善瑞芬太尼誘導的大鼠痛覺過敏的機制

李洪影，龐紅利，祁向雯

河南大學第一附屬醫院麻醉與圍術期醫學科，開封 475001

瑞芬太尼屬于μ 型阿片受體激動劑，是一種起效快、代謝快的臨床常用麻醉藥，但其在發揮麻醉效應的同時，也會誘發痛覺過敏，導致患者術后疼痛敏化，加重患者的痛苦［1-3］。目前，瑞芬太尼誘導痛覺過敏的機制尚未明確，只能以鎮痛藥物治療，其中以納布啡的鎮痛效果最為突出［4］。常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶2（euchromatic histone-lysineNmethyltransferase 2，EHMT2），又稱G9a，屬于組蛋白甲基轉移酶，近期的研究發現［5］，G9a參與介導神經病理性疼痛的產生、維持、發展，而鈉激活鉀通道（KCNT1，Slack）與神經元興奮性存在密切關系，故推測G9a、Slack可能參與了機體神經疼痛的發生過程。鑒于此，本研究建造了瑞芬太尼誘發大鼠術后痛覺過敏反應模型，分析納布啡對瑞芬太尼誘導的痛覺過敏的改善作用，并進一步探討納布啡對G9a、Slack表達的影響，為進一步研究納布啡的具體鎮痛機制、減輕瑞芬太尼誘導的痛覺過敏奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Ugo Basil機械痛敏測試儀、Ugo Basile熱痛敏測試儀均購自上海溪拓科學儀器有限公司；BSF-80型熒光顯微鏡（上海巴拓儀器有限公司）。

1.2 試藥

注射用鹽酸瑞芬太尼（批號20181102，江蘇恩華藥業股份有限公司）；七氟醚（批號20181214，上海恒瑞醫藥有限公司）；金霉素軟膏（批號20190118，長春翔通藥業有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 試劑盒均購自上海鈺博生物科技有限公司；兔抗大鼠膠原纖維酸性蛋白（glialfibrillaryacidicprotein，GFAP）單克隆抗體、兔抗大鼠G9a抗體、兔抗大鼠KCNT1（Slack）抗體、β-actin抗體單克隆抗體一抗均購自北京百奧萊博科技有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC，上海金穗生物科技有限公司）；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記山羊抗兔二抗（北京中山金橋生物有限公司）。

1.3 動物

SPF級雄 性SD 大 鼠，55 只，7 周 齡，體 質 量 為250～270 g，購自河南省實驗動物中心，生產許可證號SCXK（豫）2017-0001。實驗開展前適應性飼養1周，大鼠可自由進食、進水，環境溫度維持在22℃±2℃，每日8∶00—20∶00 開燈，20∶00—次日8∶00熄燈。

2 方法

2.1 分組與造模

從55只大鼠中隨機抽取30只，分為對照組、瑞芬太尼組、切口痛組，每組10只，其余25只建造瑞芬太尼誘發大鼠術后痛覺過敏反應模型［6］，20 只造模成功的大鼠隨機分為模型組、納布啡組，每組10只。瑞芬太尼組、模型組、納布啡組均用七氟醚吸入麻醉，再用體積分數為75%的乙醇消毒腹部皮膚，皮下刺入頭皮針，以膠帶固定，連接輸液泵持續泵注瑞芬太尼0.04 mg·kg－1，0.8 m L·h－1，30 min，對照組僅輸注等體積（0.4 m L）生理鹽水，輸注時間同上。各組完成輸注5 min后，對切口痛組、模型組、納布啡組進行左后足底切口術干預，即在左后足底進行碘伏消毒，用11號刀片從近端0.5 cm 開始向趾端取長約1 cm的切口，切開皮膚、筋膜后，挑起足底肌肉，縱向切割，保持起止附著點完整。用紗布按壓止血，取5-0尼龍絲線縫合皮膚，切口處覆蓋以金霉素軟膏抗感染。瑞芬太尼組和對照組大鼠僅固定至手術臺上相同時間。納布啡組在泵注瑞芬太尼前3 min，靜注0.6 mg·kg－1納布啡，其他各組注射等體積生理鹽水。造模成功的標準：與正常大鼠比較，造模大鼠造模后48 h 的機械縮足反應閾（paw withdrawal mechanical threshold，PWMT）、熱縮足 反應潛伏 期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）下降。

2.2 大鼠痛覺行為學測定

在造模后6、12、24、48 h進行痛覺行為學測定，用Ugo Basile機械痛敏測試儀檢測大鼠PWMT。將大鼠置于檢測箱中，檢測箱底部有金屬網，待大鼠適應15 min后，將測試儀探針對準其左后足底切口附近，啟動測試儀，若大鼠出現抬足行為則視為陽性反應，記錄測試儀啟動至大鼠抬足的測量值。每個測試重復3次，間隔5 min，計算平均測量值，即PWMT。用Ugo Basile熱痛敏測試儀檢測大鼠PWTL，將大鼠置于有玻璃底的箱內，適應15 min，調整測試儀的紅外線熱輻射探頭強度，使其產生熱量刺激大鼠10 s，將測試儀紅外線探頭對準足底切口，啟動測試儀，記錄測試儀啟動至大鼠移開左足的時間，計算PWTL，計算方法同上。

2.3 酶聯免疫吸附（ELISA）檢測脊髓背角炎癥因子

完成最后1次痛覺行為學檢測后，將大鼠以頸椎脫臼的方式處死，快速剪開大鼠椎弓根，暴露脊髓組織，取大鼠左側L4～6脊髓背角組織，保留在－80℃冰箱內。組織勻漿，4℃以1 500 r·min－1離心30 min，半徑為10 cm，取上清液。按大鼠TNF-α、IL-1βELISA 試劑盒操作說明書操作，用酶標儀檢測450 nm處的吸光度，根據標準曲線計算TNF-α、IL-1β的含量。

2.4 免疫熒光法檢測脊髓背角星形膠質細胞的激活情況

大鼠處死后取出L4～5脊髓段，固定2 h，置于質量濃度為300 g·L－1的蔗糖溶液內（4℃）脫水3 d，制作厚25μm 的切片。用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次5 min。室溫下以血清封閉，1 h后加入一抗，即抗GFAP 單克隆抗體（1∶200），次日用PBS沖洗后，加入FITC 標記的二抗（1∶200），室溫下避光孵育，1 h后用PBS沖洗，隨機挑選切片置于載玻片上，于熒光顯微鏡下用FITC濾鏡觀察、拍照。

2.5 脊髓背角G9a、Slack蛋白表達水平檢測

用Western blot檢測大鼠脊髓背角組織G9a蛋白、Slack總蛋白以及膜蛋白的表達水平。在大鼠脊髓背角組織內加入預冷的組織蛋白裂解液，研磨為勻漿，在4℃以12 000 r·min－1離心10 min，離心半徑為10 cm，取上清液，即脊髓背角組織總蛋白。用膜蛋白提取試劑盒，按說明書操作提取膜蛋白，并在95℃下變性5 min，用BCA 法檢驗蛋白濃度，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，將膜置于質量濃度為50 g·L－1的脫脂牛奶中于室溫下封閉2 h，洗膜后加入一抗，包括兔抗大鼠G9a抗體、兔抗大鼠KCNT1（Slack）抗體和β-actin抗體（1∶1 000），4℃孵育過夜，用PBS清洗3次，每次5 min，加入HRP 標記的山羊抗兔二抗（1∶2 000），室溫孵育2 h，用PBS清洗3次，每次5 min，置于暗室內加入發光試劑曝光，掃描成像。用Gene Tools圖像分析軟件進行條帶灰度值分析，以目的蛋白條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值反映目的蛋白的相對表達水平。

2.6 統計學方法

用SPSS 19.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多樣本計量資料比較用單因素方差分析，兩樣本間的比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠造模后不同時間點的機械痛閾

隨著造模時間的延長，瑞芬太尼組、切口痛組、模型組大鼠的PWMT 值持續降低，而納布啡組PWMT 值持續增大（P＜0.05），對照組無明顯變化（P＞0.05）；與對照組比較，瑞芬太尼組、切口痛組、模型組、納布啡組大鼠的PWMT 值均減小（P＜0.05）；與瑞芬太尼組比較，模型組PWMT 值減小、納布啡組PWMT 值增大（P＜0.05），切口痛組與之比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，納布啡組PWMT值增大（P＜0.05）。結果見表1。

表1 大鼠造模后6、12、24、48 h PWMT值的比較（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of PWMT values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

表1 大鼠造模后6、12、24、48 h PWMT值的比較（±s，n＝10）Tab.1 Comparison of PWMT values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與瑞芬太尼組比較，b P＜0.05；與切口痛組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05；與6 h比較，e P＜0.05；與12 h比較，f P＜0.05；與24 h比較，g P＜0.05。

項目 PWMT／g 6 h 12 h 24 h 48 h對照組 21.32±1.28 20.75±1.08 20.39±1.47 20.63±1.14瑞芬太尼組 16.55±2.31a 14.45±1.74ae 13.05±1.79aef 12.01±1.28aefg切口痛組 15.25±1.79a 13.48±1.75ae 12.69±1.26aef 11.41±1.16aefg模型組 12.36±1.08abc 11.12±1.07abce 7.36±1.33abcef 6.25±1.15abcefg納布啡組 17.39±1.35abcd 18.06±1.19abcde 19.47±1.03abcdef 20.39±1.17abcdefg F 40.537 74.430 147.853 278.538 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.2 大鼠造模后不同時間點的熱痛閾

隨造模時間的延長，瑞芬太尼組、切口痛組、模型組大鼠的PWTL值持續減小，而納布啡組PWTL 值持續增大（P＜0.05），對照組無明顯變化（P＞0.05）；與對照組比較，瑞芬太尼組、切口痛組、模型組、納布啡組的PWTL 值均減小（P＜0.05）；與瑞芬太尼組比較，模型組PWTL 值減小、納布啡組PWTL 值增大（P＜0.05），切口痛組與之比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，納布啡組PWTL 值增大 （P＜0.05）。結果見表2。

表2 大鼠造模后6、12、24、48 h PWTL值的比較（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of PWTL values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

表2 大鼠造模后6、12、24、48 h PWTL值的比較（±s，n＝10）Tab.2 Comparison of PWTL values of rats at 6，12，24 and 48 hours after modeling（±s，n＝10）

注：與對照組比較，a P＜0.05；與瑞芬太尼組比較，b P＜0.05；與切口痛組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05；本組各時間段比較，e P＜0.05。

項目 PWTL／s造模后6 h 造模后12 h 造模后24 h 造模后48 h對照組 27.69±1.08 27.59±1.12 27.83±1.57 27.06±1.44瑞芬太尼組 18.05±2.01ae 17.95±1.49ae 15.45±1.99ae 14.71±1.88ae切口痛組 17.94±2.09ae 16.27±1.77ae 15.09±1.36ae 14.11±1.51ae模型組 15.42±1.22abce 14.29±1.67abce 12.06±1.34abce 10.28±1.05abce納布啡組 20.42±1.55abcde 22.42±1.69abcde 24.09±1.75abcde 26.33±1.87abcde F 81.958 116.045 171.219 236.023 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

3.3 大鼠脊髓背角細胞炎癥因子的表達

與對照組比較，瑞芬太尼組、切口痛組、模型組、納布啡組大鼠TNF-α、IL-1β的水平升高（P＜0.05）；與瑞芬太尼組比較，模型組TNF-α、IL-1β的水平升高，納布啡組TNF-α、IL-1β的水平降低（P＜0.05），切口痛組與瑞芬太尼組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，納布啡組TNF-α、IL-1β的水平降低（P＜0.05）。結果見表3。

表3 大鼠脊髓背角的細胞炎癥因子表達水平的比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of expression of inflammatory cytokines in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

表3 大鼠脊髓背角的細胞炎癥因子表達水平的比較（±s，n＝10）Tab.3 Comparison of expression of inflammatory cytokines in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

注：與 對 照 組 比 較，a P ＜0.05；與瑞 芬 太 尼 組 比 較，b P＜0.05；與 切 口 痛 組 比 較，c P ＜0.05；與 模 型 組 比 較，d P＜0.05。

項目 TNF-α／（pg·mg－1）IL-1β／（pg·mg－1）對照組27.35±3.26 49.81±6.34瑞芬太尼組 55.18±6.77a 149.42±11.71a切口痛組 56.39±7.05a 150.08±10.66a模型組 69.82±9.64abc 186.05±19.25abc納布啡組 39.97±5.37abcd 81.67±8.22abcd F 58.888 213.808 P＜0.001 ＜0.001

3.4 大鼠脊髓背角星形膠質細胞激活狀態

與對照組比較，瑞芬太尼組、切口痛組的星形膠質細胞明顯激活，模型組激活星形膠質細胞的密度最大，納布啡組較瑞芬太尼組、切口痛組有所改善。結果見圖1。

圖1 大鼠脊髓背角星形膠質細胞激活狀態（×200）Fig.1 Activation of astrocytes in spinal dorsal horn of rats（×200）

3.5 大鼠脊髓背角G9a、Slack總蛋白以及膜蛋白的表達

與對照組比較，瑞芬太尼組、切口痛組、模型組、納布啡組G9a蛋白的相對表達量升高，Slack總蛋白與膜蛋白的相對表達量降低（P＜0.05）；與瑞芬太尼組比較，模型組G9a蛋白的相對表達量升高，Slack總蛋白與膜蛋白的相對表達量降低（P＜0.05），納布啡組G9a蛋白的相對表達量降低，Slack總蛋白與膜蛋白的相對表達量升高（P＜0.05），切口痛組與之比較差異無統計學意義（P＞0.05）；與模型組比較，納布啡組G9a蛋白的相對表達量降低，Slack總蛋白與膜蛋白的相對表達量升高（P＜0.05）。結果見表4、圖2。

圖2 Western blot檢測大鼠脊髓背角G9a、Slack總蛋白以及膜蛋白的表達水平Fig.2 Western blot detection of the expression levels of G9a，Slack total protein and membrane protein in the dorsal horn of rat spinal cord

表4 大鼠脊髓背角G9a、Slack總蛋白以及膜蛋白表達水平的比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of expression of G9a，Slack total protein and membrane protein in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

表4 大鼠脊髓背角G9a、Slack總蛋白以及膜蛋白表達水平的比較（±s，n＝10）Tab.4 Comparison of expression of G9a，Slack total protein and membrane protein in spinal dorsal horn of rats（±s，n＝10）

注：與 對 照 組比較，a P ＜0.05；與 瑞 芬 太 尼 組 比 較，b P＜0.05；與切口痛組比較，c P＜0.05；與模型組比較，d P＜0.05。

項目 G9a Slack總蛋白 膜蛋白對照組0.92±0.05 0.93±0.06 0.91±0.07瑞芬太尼組 1.19±0.15a 0.69±0.08a 0.59±0.05a切口痛組 1.22±0.18a 0.55±0.09a 0.46±0.06a模型組 1.36±0.12abc 0.46±0.06abc 0.32±0.04abc納布啡組 1.03±0.14abcd 0.81±0.05abcd 0.72±0.07abcd F 16.100 74.628 149.000 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

4 討論

瑞芬太尼可誘發痛覺過敏已被證實，目前其往往與其他藥物聯用麻醉，其中與納布啡聯用的頻率最高［7］。納布啡屬于混合型阿片類受體調控劑，可激活κ型阿片受體，同時拮抗μ受體，緩解由μ受體激動劑所致的不良反應［8］。有研究發現［9］，納布啡可預防瑞芬太尼全麻患者術后疼痛、寒戰等的發生，因此推薦納布啡為預防瑞芬太尼誘發痛覺過敏的一線藥物。

本研究在大鼠吸入七氟醚、泵注瑞芬太尼麻醉的狀態下進行切口手術，模擬目前廣泛應用于人體的麻醉手術，結果顯示，泵注瑞芬太尼、切口手術均可誘發明顯機械性痛敏和熱痛敏，泵注瑞芬太尼可在一定程度上加劇大鼠術后的疼痛感，而預先采用納布啡可使大鼠術后PWMT 和PWTL 值上升，且伴隨造模時間的延長，大鼠PWMT 和PWTL 值持續上升，表明納布啡可改善由瑞芬太尼誘發的痛覺過敏。近20年來，諸多研究證明中樞、外周神經炎癥在神經病理性疼痛的產生與維持中發揮重要作用，在個體發生炎癥或者神經損傷后，神經膠質細胞，如中樞星形膠質細胞可迅速增生，釋放大量炎癥遞質、細胞因子，影響神經元周圍離子環境，突觸間隙的興奮性神經遞質谷氨酸濃度提高，誘發中樞神經元敏感化［10-12］。因此，眾多學者從抑制中樞星形膠質細胞活化、降低炎癥因子水平出發，探索鎮痛藥物用于改善神經病理性疼痛的效果［13-14］。本研究結果顯示，納布啡組大鼠脊髓背角星形膠質細胞的密度明顯低于模型組，更接近對照組，且TNF-α、IL-1β的水平明顯低于模型組，表明星形膠質細胞激活、TNF-α與IL-1β釋放參與了瑞芬太尼誘發痛覺過敏的產生和維持過程，而納布啡可通過抑制星型膠質細胞活化、下調炎癥因子水平達到鎮痛的目的。

G9a是一種由EHMT2 編碼、負責定位組蛋白甲基化位點的組蛋白修飾酶，在抑制基因轉錄方面的作用已經被人熟知，其可通過催化H3K9 的二甲基化（histone H3 lysine 9 dimethylation，H3K9Me2），調控神經元中鉀離子通路表達沉默，這是神經病理性疼痛的表觀遺傳學相關機制［15-16］。神經損傷、炎癥可誘發H3K9Me2上調，在鉀離子通路啟動子部位富集，抑制相關基因的轉錄，從而導致多種鉀離子通路沉默［17］。本研究結果顯示，模型組造模后48 h 的G9a蛋白水平上調，而納布啡組G9a蛋白的水平下調，表明G9a通路參與了瑞芬太尼誘導痛覺過敏的形成過程，而納布啡可下調G9a通路，這可能是納布啡鎮痛的作用機制之一。Slack通路是由KCNT1基因編碼的鈉離子激活的鉀離子通路，廣泛存在于谷氨酸能神經突觸上，其所介導的鉀離子外向電流，可降低神經元興奮性，表現為興奮性突觸后膜電流、動作電位的振幅和頻率下降［18］。Slack蛋白受到抑制后，可增強由氨甲基膦酸（aminomethyl phosphonic，AMPA）受體所介導的神經元興奮性，抑制AMPA受體-Slack負反饋調控神經元的興奮性，提高興奮性谷氨酸突觸后電位［19-20］。與對照組比較，模型組Slack總蛋白和膜蛋白的表達下調，表明Slack 通路也參與了由瑞芬太尼誘導的痛覺形成過程；與模型組比較，納布啡組Slack總蛋白和膜蛋白的表達上調，表明納布啡可通過上調Slack通路發揮鎮痛效應。

綜上所述，預先使用納布啡可改善由瑞芬太尼誘導的痛覺過敏，可抑制星形膠質細胞活化、降低炎癥因子水平，其可能是通過下調G9a、上調Slack的表達實現鎮痛效果。