過表達脂肪非典型鈣黏蛋白4對結直腸癌化療耐藥的影響

楊少賓，王昱良，李俊娜，王朝杰

1.黃河三門峽醫院消化內科，三門峽 472000；2.河南省人民醫院腫瘤內科，鄭州 450003

多項研究表明［1-2］，結直腸癌病死率高的一個重要原因為化療耐藥，包括原發性、繼發性2種，其中繼發性耐藥較常見，可導致病情反復或加重，使治療的難度增大。脂肪非典型鈣黏蛋白4（fat atypical cadherin 4，FAT4）為鈣黏蛋白超家族成員之一，屬于單跨膜蛋白受體，能對上游相關信號通路的細胞外信號向細胞內傳導進行調控［3］。有研究發現［4-5］，FAT4屬于腫瘤抑制基因，在多種腫瘤中呈低表達，可能參與正常組織向腫瘤組織轉變的過程。目前，FAT4過表達對人結直腸癌細胞繼發性化療耐藥性的影響及具體機制尚不明確。本文分析FAT4過表達對人結直腸癌HCT116細胞繼發性化療耐藥性的影響，并探討其作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Mx3005P型實時熒光定量分析（RT-PCR）儀（美國安捷倫科技公司）；TC2323型CO2培養箱（美國Shellab公司）；CH2-TKC-3 型倒置光學顯微鏡（日本奧林巴斯株式會社）；Mod 550型全自動酶標儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 試藥

奧沙利鉑（杭州賽諾菲安萬特民生制藥有限公司）；青霉素、鏈霉素均購自美國Sigma公司；RPMI-1640培養基（美國HyClone公司）；LipofectamineTM3000 試 劑（美 國Life Technologies 公 司）；過 表 達FAT4慢病毒核心質粒、空載體慢病毒均購自中國科學院上海生命科學研究院；Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒［東仁化學科技（上海）有限公司］；FAT4、β-actin引物序列均購自日本Ta KaRa Bio株式會社；兔抗人FAT4、P53、磷酸化-p53（p-p53）、鼠雙微粒體基因2（murine double minute2，MDM2）一抗及山羊抗兔IgG 二抗均購自美國Novus Biologicals公司。

1.3 細胞系

正常人類腸黏膜上皮細胞系FHC、人結直腸癌HCT116細胞均購自中國科學院上海細胞生物學研究所。

2 方法

2.1 細胞培養

取正常人類腸黏膜上皮細胞系FHC、人結直腸癌HCT116 細胞，分別接種于含質量濃度為50 mg·L－1胎牛血清的RPMI-1640培養液中，置于體積分數5%二氧化碳培養箱中培養，溫度37℃，每2 d更換1次培養液，實驗前培養4 d。

2.2 結直腸癌細胞與正常腸黏膜上皮細胞中FAT4 m RNA 表達水平的檢測

用RT-PCR 法檢測。取處于對數生長期的正常人類腸黏膜上皮細胞、人結直腸癌HCT116細胞，用Trizol法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，進行RTPCR 反 應。反 應 體 系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（2×）12.5μL，cDNA 模 版2μL，上、下 游 引 物 各1μL，雙 蒸 水8.5 μL。反 應 條 件：95 ℃預 變 性，5 min；95℃變性，5 s；60℃退火延伸，20 s，40 個 循環。引物序列見表1。進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統分析電泳條帶，以β-actin為內參，計算FAT4 m RNA 的相對表達水平（2－△△CT）。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

2.3 過表達人結直腸癌HCT116 細胞中的FAT4及轉染

用胰酶消化、收集處于對數生長期的HCT116細胞，根據病毒包被、轉染試劑要求，將過表達FAT4慢病毒核心質粒包裝成病毒，按照LipofectamineTM3000 試劑說明書，用其與空載體慢病毒轉染HCT116細胞，6 h。隨后更換新鮮的DMEM 培養液，繼續培養48 h。將人結直腸癌HCT116 細胞分為3組：以過表達FAT4 病毒轉染HCT116 細胞作為實驗組，以空載體病毒轉染HCT116 細胞作為對照組，以無病毒轉染HCT116 細胞作為空白組。轉染48 h后，用倒置熒光顯微鏡計數細胞總數、發綠色熒光細胞數，計算轉染效率。轉染效率＝（發綠色熒光細胞數÷細胞總數）×100%。

2.4 轉染后HCT116細胞中FAT4 mRNA 表達水平的檢測

用RT-PCR 進 行 檢 測。取2.3 項 下 的3 組 細胞，提取總RNA，逆轉錄合成cDNA，按照2.2項下方法進行RT-PCR 反應。進行瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠圖像分析系統分析電泳條帶，以β-actin為內參，計算FAT4 m RNA 的相對表達水平（2－△△CT）。

2.5 轉染后HCT116 細胞中FAT4 蛋白表達水平的檢測

用Western blot檢測。取2.3項下3組細胞，用PBS清洗2次，RIPA 裂解液進行冰上裂解，30 min。以4℃，12 000 r·minL－1離心10 min，半徑為8 cm，取上清液。用BCA 法進行蛋白定量，沸水浴變性10 min。以質量濃度120 g·L－1的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜，用脫脂奶粉封閉1 h。加兔抗人FAT4一抗（1∶1 000），4℃，搖床孵育，過夜。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加Ig G二抗（1∶2 500），室溫下孵育2 h。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加ECL 增強化學發光劑。用Image Quant LAS4000生物分子成像儀曝光成像，觀察條帶灰度值。目的蛋白水平＝目的蛋白條帶灰度值÷β-actin條帶灰度值。

2.6 FAT4 過表達對人結直腸癌HCT116 細胞化療耐藥影響的檢測

用CCK-8法檢測。取2.3項下3 組細胞，接種于96孔板，各組設5個復孔。待細胞貼壁后，以不同質量濃度（1.6、2.4、3.2、4.0、4.8μg·m L－1）的奧沙利鉑干預各組細胞，以未處理細胞為對照孔，僅加培養液200μL。處理24 h后，各孔加CCK-8 5μL，置于體積分數5%CO2培養箱中培養4 h，箱內溫度37℃。以含質量濃度為1.0 mg·L－1DMSO 的DMEM 溶液加入各孔，振蕩10 min。待結晶溶解后，用酶標儀檢測570 nm 處的吸光度（A），并計算藥物半數抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）及 化療耐藥 倍 數（resistance fold，RF）。IC50＝（實驗孔吸光度值÷對照孔吸光度值）×100%。RF＝耐藥細胞IC50值÷親本細胞IC50值。

2.7 FAT4 過表達對人結直腸癌HCT116 細胞凋亡率影響的檢測

用流式細胞術進行檢測。取2.3項下3組細胞，接種于96孔板，待細胞貼壁后，以最接近IC50值質量濃度（3.2μg·m L－1）的奧沙利鉑干預各組細胞24 h。隨后各孔加不含EDTA 的胰酶消化，以EP管收集各組細胞，用PBS 洗滌細胞2 次。管內加1×binding buffer 200μL重懸細胞，于細胞重懸液內加入Annexin V-PE 5 μL，混勻，室溫下避光孵育10 min。以7-AAD 5μL加入各管，吹打混勻，4 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

2.8 免疫共沉淀實驗

取2.3項下3組細胞，接種于96孔板，待細胞貼壁后，以質量濃度3.2μg·m L－1的奧沙利鉑干預24 h。將細胞置于RIPA 裂解液中裂解，以12 000 r·min－1離心15 min，離心半徑8 cm，轉移上清至新的離心管。用PBS洗滌蛋白A／G 瓊脂糖珠2次，制備成20μL 蛋白A／G 瓊脂糖珠工作液。4℃，振蕩10 min，去除非特異性結合蛋白干擾。以12 000 r·min－1離心15 s，離心半徑為8 cm，轉移上清液至新的離心管，棄蛋白A／G 瓊脂糖珠，加p53 抗體或MDM2抗體（或FAT4抗體）5μL。4℃，緩慢振蕩過夜。以12 000 r·min－1離心15 s，離心半徑為8 cm，收集免疫沉淀產物。以經過預冷的PBS洗滌，重復3次。加上樣緩沖液15μL，置于沸水浴中變性5 min，用Western blot檢測FAT4、p53、p-p53及MDM2蛋白的表達水平。

2.9 p53、p-p53及MDM2蛋白相對表達量的檢測

用Western blot檢測。取2.3項下3組細胞，接種于96 孔板，待細胞貼壁后，以質量濃度為3.2μg·m L－1的奧沙利鉑干預各組細胞24 h，開始實驗。細胞裂解、蛋白定量、沸水浴變性、凝膠電泳、轉膜、脫脂奶粉封閉等步驟同1.2.5。加兔抗人p53（1∶1 000）、p-p53（1∶1 000）及MDM2（1∶1 000）一抗，置于4℃搖床中孵育過夜。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加IgG 二抗（1∶2 500），室溫下孵育2 h。用TBST 洗膜4次，每次10 min。加ECL 增強化學發光劑，曝光成像，觀察條帶灰度值。目的蛋白水平＝目的蛋白條帶灰度值／β-actin條帶灰度值。

2.10 統計學方法

用SPSS 19.0軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組計量資料比較用單因素方差分析，兩兩樣本比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 結直腸癌細胞與正常腸黏膜上皮細胞中FAT4的表達水平

人結直腸癌HCT116 細胞中FAT4 mRNA 的相對表達量為（0.36±0.12），正常人類腸黏膜上皮細胞中FAT4 m RNA 的相對表達量為（1.02±0.35），差異有統計學意義（t＝3.989，P＝0.002）。FAT4在結直腸癌HCT116細胞中呈低表達。

3.2 轉染效率

經檢測，對照組轉染效率為89.58%，實驗組轉染效率為90.05%，可用于后續實驗。結果見圖1。

圖1 LipofectamineTM 3000介導質粒轉染HCT116細胞后的顯微鏡下照片Fig.1 Pictures of transfected HCT116 cells mediated by LipofectamineTM 3000 plasmid under microscope

3.3 HCT116細胞中FAT4 m RNA、蛋白的相對表達量

各組FAT 4 mRNA、蛋白相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白組、對照組比較，實驗組FAT 4 mRNA、蛋白的相對表達量升高（P＜0.05）；空白組與對照組FAT 4 mRNA、蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表2、圖2。

圖2 Western blot檢測HCT116細胞中FAT4蛋白的表達量Fig.2 Expression of FAT4 protein in HCT116 cells detected by Western blot

表2 各組FAT4 mRNA、蛋白相對表達量的比較（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group（±s，n＝5）

表2 各組FAT4 mRNA、蛋白相對表達量的比較（±s，n＝5）Tab.2 Comparison of relative expression of FAT4 mRNA and protein in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項目 FAT4 mRNA FAT4蛋白空白組0.36±0.11 0.27±0.10對照組 0.34±0.13 0.26±0.11實驗組 1.15±0.19ab 0.98±0.18ab F 49.178 46.908 P＜0.001 ＜0.001

3.4 過表達FAT4對HCT 細胞化療耐藥性的影響

各組細胞增殖活性均隨奧沙利鉑質量濃度增加而降低（P＜0.05）。各組IC50值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白組、對照組比較，實驗組IC50值降低（P＜0.05）；空白組與對照組IC50值比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。空白組、對照組和實驗組RF 分別為5.65、5.75、2.18 倍。結果見表3、表4。

表3 各組不同奧沙利鉑質量濃度時A值的比較（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group（±s，n＝5）

表3 各組不同奧沙利鉑質量濃度時A值的比較（±s，n＝5）Tab.3 Comparison of A value of different oxaliplatin concentrations in each group（±s，n＝5）

奧沙利鉑質量濃度／（μg·mL－1）空白組 對照組 實驗組1.6 93.02±4.51 92.54±4.96 87.65±3.65 2.4 79.12±4.03 78.65±4.13 70.05±3.44 3.2 63.05±3.28 62.68±3.77 52.13±2.96 4.0 36.04±2.74 35.74±2.61 22.36±2.14 4.8 15.02±1.08 14.54±1.02 9.54±1.07 F 449.074 394.159 663.965 P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 各組IC50值的比較（±s，n＝5）Tab.4 Comparison of IC50 values in each group（±s，n＝5）

表4 各組IC50值的比較（±s，n＝5）Tab.4 Comparison of IC50 values in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項目 IC50／（μg·mL－1）空白組3.52±0.05對照組 3.51±0.02實驗組 3.28±0.01ab F 61.444 P 0.016

3.5 過表達FAT4對HCT 細胞凋亡的影響

各組細胞凋亡率比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。與空白組、對照組比較，實驗組細胞凋亡率升高（P＜0.05）；空白組與對照組細胞凋亡率比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖3、表5。

圖3 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡Fig.3 Comparison of apoptosis detected by flow cytometry in each group

表5 各組細胞凋亡率的比較（±s，n＝5）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n＝5）

表5 各組細胞凋亡率的比較（±s，n＝5）Tab.5 Comparison of apoptosis rate in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項目 細胞凋亡率空白組4.61%±0.41%對照組 5.02%±0.43%實驗組 23.62%±0.85%ab F 788.709 P＜0.001

3.6 Co-IP 實驗結果及p53、p-p53、MDM2 蛋白 的相對表達量

Co-IP實驗結果顯示，FAT4與p-p53、MDM2均存在特異的相互作用。

Western blot結果顯示，各組p-p53、MDM2 蛋白的相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；各組p53蛋白相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白組、對照組比較，實驗組p-p53蛋白的相對表達量升高，MDM2蛋白的相對表達量降低（P＜0.05）；空白組與對照組p-p53、MDM2蛋白的相對表達量比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖4、表6。

圖4 Western blot檢測各組p53、p-p53、MDM2蛋白的表達水平Fig.4 Expression levels of P53，p-P53 and MDM2 proteins detected by Western blot in each group

表6 各組P53、p-P53、MDM2蛋白相對表達量的比較（±s，n＝5）Tab.6 Comparison of the relative expression of P53，p-P53 and MDM2 in each group（±s，n＝5）

表6 各組P53、p-P53、MDM2蛋白相對表達量的比較（±s，n＝5）Tab.6 Comparison of the relative expression of P53，p-P53 and MDM2 in each group（±s，n＝5）

注：與空白組比較，a P＜0.05；與對照組比較，b P＜0.05。

項目 P53 p -P53 MDM2空白組0.72±0.09 0.27±0.03 0.65±0.06對照組 0.73±0.08 0.26±0.04 0.65±0.08實驗組 0.73±0.09 0.78±0.05ab 0.29±0.03ab F 0.022 265.300 59.450 P 0.978 ＜0.001 ＜0.001

4 討論

結直腸癌為臨床常見的消化系統惡性腫瘤，多數患者早期癥狀不典型，確診時通常已處于中晚期，病死率高［6-7］。FAT4為原鈣黏蛋白家族成員之一，在細胞增殖及細胞平板極性調節中發揮重要作用［8-9］。有研究顯示［10-12］，FAT4在肝癌、胃癌和乳腺癌等腫瘤中呈低表達，且進一步低表達可增強腫瘤細胞的增殖、侵襲能力。目前，盡管FAT4 涉及多種惡性腫瘤，但其在結直腸癌中的作用，特別是對繼發性化療耐藥性的影響及機制仍不清楚。本研究對FAT4對結直腸癌繼發性化療耐藥性問題進行分析，化療藥物選擇奧沙利鉑，因其應用較廣泛，具有一定典型性。

FAT 家族成員能對Hippo信號通路進行調節，參與正常機體細胞發育、增殖過程，其中FAT4同樣被發現可影響腫瘤進展［13］。另外，FAT4 還是重要的甲基化修飾因子，可導致基因突變的風險增加，降低基因 錯 配 修 復 能 力［14-15］。研 究 證 實［16］，FAT4 高度甲基化能引發FAT4低表達，增強腫瘤細胞侵襲、遷移能力，還可限制YAPI的表達，對哺乳動物心臟生長造成影響。本研究發現，與空白組、對照組比較，實驗組IC50值、RF降低，CCK-8實驗A值降低，凋亡率增加，提示過表達FAT4 能抑制人結直腸癌HCT116細胞增殖，促進細胞凋亡，增強化療敏感性。WEI R 等［17］研究也發現，FAT4過表達能抑制大腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，與本研究共同證實FAT4過表達的作用。

p53基因與其上、下游基因共同構成復雜的調控網絡，其中MDM2-p53信號通路發揮重要作用。p53基因是一個經典抑癌基因，激活后能對下游一系列基因的表達產生影響，可促進細胞凋亡及DNA 修復，阻滯細胞周期進展。研究發現［18］，p53 失活在結直腸癌發生、發展過程中發揮重要作用。還有學者提出［19］，細胞在暴露于DNA 損傷藥物后，可導致p53表達水平上升，推測p53可能在促進DNA 修復中有一定作用。MDM2主要作為p53的負性調控因子存在，可特異性標記p53蛋白，p53蛋白高表達可激活MDM2的轉錄和翻譯，使p53蛋白被泛素-蛋白酶體系統降解，降低細胞內p53的含量。呂磊等［20］發現，膀胱癌耐藥菌株增殖受MDM2-p53通路影響。本研究推測FAT4 過表達是否為調節HCT116 細胞內P53、MDM2表達，發揮增強HCT116細胞化療耐藥性作用。結果顯示，實驗組p-p53的蛋白相對表達量增高，MDM2蛋白的相對表達量降低，且Co-IP 實驗證明FAT4與p-p53、MDM2有互相作用，提示過表達FAT4可調節p-p53、MDM2蛋白的表達。因此，推測FAT4過表達降低HCT116細胞化療耐藥性的作用機制，可能與調節MDM2-p53通路有關。

綜上所述，FAT4 過表達可降低結直腸癌HCT116細胞化療耐藥性，增加化療敏感性，該作用可能與MDM2-p53通路有關，這一結論可為臨床指導結直腸癌化療耐藥治療提供新方向。本研究不足之處在于，僅選用一個細胞株，未能全面概括FAT4對不同亞型細胞化療耐藥的影響及機制，故仍需深入研究，并在臨床加以證實。