固相萃取-高效液相色譜法測定水產品中甲基睪酮的含量

楊開智 梁 丹 黃生林

（常德市畜牧水產事務中心，湖南 常德 415000）

甲基睪酮（MET）是一種人工合成的代謝類固醇，屬于蛋白同化激素，具有增強雄性體性和蛋白同化雙重作用，應用于水產養殖可以提高產量和控制性別[1-2]。然而其在人體的極少殘留也會造成人內分泌紊亂、性早熟、胎體中毒、致畸致癌等嚴重后果[3]。因此，甲基睪酮在水產品中的殘留引起了人們的重視，世界上大多數國家禁止在水產品養殖和治療中使用甲基睪酮。2001 年我國農業部實施的行業標準NY 5070—2001《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》中，將甲基睪酮列為禁用藥物。2003 年農業部發布的235 號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規定甲基睪酮為禁用獸藥。

目前甲基睪酮的檢測方法是高效液相色譜法[4-5]和液相色譜-串聯質譜法[6-7]。液相色譜串聯質譜法提高了對目標物的準確性和靈敏度，但是由于儀器昂貴，檢測成本高，不易推廣。高效液相色譜法在使用上方便、快捷，靈敏度能達到要求，因此本文對前處理過程和色譜條件進行優化，利用紫外檢測器對甲基睪酮進行了檢測。實驗結果表明，改進后的方法縮短了前處理時間，靈敏度高，能實現對甲基睪酮的快速檢測，在提高實驗樣品回收率的同時，也提高了工作效率。這對加強MET 的檢測、保障人們的飲食安全和身體健康具有重要意義。

1 實驗

Waters Alliance 2695 高效液相色譜儀，配備2489 紫外可見光檢測器；高速冷凍離心機（日本日立公司）；超聲波清洗器（昆山超聲波儀器廠）；精密電子天平（梅特勒-托利多稱重設備系統有限公司）；24 孔氮吹儀（美國Organmation 公司）；微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠）。

甲基睪酮標準品（德國Dr. Ehrenstorfer 公司，純度≥98%）；乙酸乙酯、甲醇（色譜純，德國Merck 公司）；正己烷（色譜純，天津科密歐化學試劑有限公司）；固相萃取小柱（美國Waters 公司）；實驗室用水均為屈臣氏蒸餾水。

標準儲備液：精確稱取適量的甲基睪酮，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成濃度為100 μg/mL 的標準儲備液。-18 ℃避光保存，有效期6 個月。

標準中間液：分別準確吸取0.5 mL 標準儲備液至50 mL 容量瓶中，甲醇定容，甲基睪酮濃度為1 μg/mL。-18 ℃避光保存，有效期3個月。

稱取5 g（精確至0.01 g）樣品置于50 mL離心管中，向離心管中加入10 mL 乙酸乙酯，渦旋混勻1 min，于超聲波振蕩器中常溫超聲10 min，6000 r/min 離心8 min，取上清液置于旋蒸瓶中，重復操作一次，合并提取液。將提取液于40 ℃水浴中減壓蒸發至干。加入2 mL 甲醇、1 mL 水，洗滌瓶壁后混勻，繼續加入4 mL正己烷，渦旋混勻后將溶液轉移至離心管中，重復操作一次。

將離心管放入離心機于5000 r/min 離心5 min，棄去上層正己烷，將下層甲醇水溶液過親水-親脂平衡（HLB）柱(使用前用4 mL 甲醇和4 mL水活化)，20% 甲醇水溶液淋洗后真空抽干，加入4 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液于40 ℃水浴下氮吹至干，加入1 mL 流動相充分溶解，經0.22 μm 聚四氟乙烯膜過濾后上機測定。

色譜柱為X-Bridgr C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為甲醇，B 為水；A、B 流動相比例為70∶30，流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm。

2 結果與討論

比較了甲醇、乙腈、乙酸乙酯以及乙醚四種常用的水產品提取溶劑。四種提取溶劑均能有效地提取水產品中的甲基睪酮。但是乙醚揮發性強，對環境危害較大；甲醇和乙腈易溶于水，水產品基質含有較多水分，在旋蒸過程中帶入不易蒸干；乙酸乙酯具有不易揮發、毒性較小、提取效率高的優點。因此本文采用乙酸乙酯作為水產品中甲基睪酮的提取溶劑。

甲基睪酮屬蛋白同化激素，脂溶性強，基質效應嚴重，有效去除雜質是準確定量和實現低檢出限的關鍵。而水產品蛋白含量高，干擾物質較多，必須采用有效的方法去除雜質。本文采用正己烷去脂和固相萃取柱萃取相結合的凈化方式，更好地去除雜質干擾，保證目標物的回收率，進一步降低目標物的檢出限。本文比較了四種不同的固相萃取柱（C18 柱、HLB 柱、中性氧化鋁柱以及MAX 柱)對甲基睪酮的凈化效果，其回收率的結果見圖1。本實驗選擇利用親水親脂的HLB柱，步驟簡單，凈化效果好。

圖1 不同固相萃取柱的目標物回收率

選擇合適的流動相使目標物能較好分離，不妨礙檢測器的正常工作在波長范圍無吸收并且保護色譜柱，保證合適的柱壓。甲基睪酮藥物的兩種常用的流動相有乙腈- 水和甲醇- 水兩種選擇，本文比較上述兩種流動相，發現甲醇-水溶液效果最好，甲基睪酮的分離效果最好。當流速為1.0 mL/min 時，從90%比例甲醇逐步降低到70%比例甲醇時甲基睪酮的分離度高，峰形好，出峰快。

圖2 甲基睪酮標準色譜峰

用甲基睪酮標準溶液配制濃度分別為0.02、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L 的標準工作溶液，取20 μL 進入高效液相色譜儀中。按照其所得峰面積的平均值與對應標準溶液的濃度作標準曲線，可得甲基睪酮色譜峰面積在濃度0.02-1.0 mg/L 范圍內呈線性關系，其標準曲線回歸方程為Y=73.4X+1.76，相關系數大于0.9994。將6.0 μg/kg 的加標樣品平行測定6 次，以10 倍信噪比對應的甲基睪酮濃度確定該方法定量限為6.0 μg/kg。

選用草魚、中華鱉、對蝦三種不同的空白水產品，按照上述“1.3 樣品前處理”進行添加回收試驗，分別添加6、30、60 μg/kg 三個水平的標準品，每個添加水平設6 個平行，按1.2 節所述條件進行加標回收率實驗，可得到回收率為71.5%-89.2%，相對標準偏差為3.24%-8.03%，具體結果見表1。說明能取得良好的回收效果。

表1 回收率和相對標準偏差

3 小結

本文通過對前處理條件和色譜條件進行優化，建立了利用液相色譜法測定水產品中甲基睪酮殘留量的方法。樣品采用乙酸乙酯提取，HLB固相萃取柱凈化。該方法簡單、快速，具有很好的適用性和可操作性，譜圖無干擾，提高了方法的準確性和重復性。通過方法學驗證，該方法可全面、準確地監測水產品中甲基睪酮藥物殘留，對水產品進行有效監控，為政府加強對水產品違規使用獸藥問題的監管提供技術支撐。