藜蒿總黃酮提取工藝優化及其抗氧化活性研究

肖愷靈 張媛媛 齊致源 付家敏 王琤韡

（江西科技師范大學生命科學學院，江西 南昌 330013）

藜蒿(Artemisia selengensis Turcz.)屬桔梗目菊科，別名蘆蒿、柳葉蒿、蔞蒿、水艾、水蒿等，為多年生草本植物，植株具清香氣味[1]。藜蒿作為一種特色植物資源，遍生于江西省鄱陽湖附近區域[2]。民間多食其嫩莖葉，全株亦可入藥，安全無副作用，其藥用價值在古本草書中已有記載，明代李時珍的《本草綱目》中寫道：“藜蒿味平甘，主五臟邪氣，風寒濕痹，補中益氣，長毛發令黑，療心懸，少食長饑；久服輕身耳目聰明不老”[3]。研究表明，藜蒿富含黃酮類、多酚類等活性成分，能夠清除多種自由基，具有良好的抗氧化活性[3-5]。因此藜蒿具有清火消炎以及治療寒冷腹痛、急性肝炎等功效，也被發現可用于治療黃膽型或無黃膽型肝炎[7]。

總黃酮（Flavonoids）是一類黃酮類化合物，屬植物次生代謝產物，具有抗腫瘤、降血壓、抗氧化及促進新陳代謝等功能[7]?，F代研究表明，總黃酮因酚羥基上的氫原子與過氧自由基結合生成黃酮自由基，進而與其他自由基反應，從而終止自由基鏈式反應[8]，因此總黃酮能夠提高機體抗氧化及清除自由基的能力，且無毒無害，可作為綠色抗氧化劑。

目前，關于藜蒿總黃酮的抗氧化等研究較少，對于藜蒿這種特色植物的開發也處于起步階段。相比于新興的微波輔助萃取法和超臨界流體萃取法，溶劑回流萃取法作為傳統的醇提法雖然耗費時間長、步驟較多，但采用的乙醇溶劑具有低毒性、價格低廉、使用簡單等優點，在工業方面提取藜蒿總黃酮時具有更大的優勢。因此本實驗采用溶劑回流萃取法，優化藜蒿提取工藝條件，為大規模提取藜蒿總黃酮提供參考依據。在單因素試驗基礎上結合正交試驗優化提取工藝，提高總黃酮得率，以DPPH 自由基清除率、OH自由基清除率和還原能力為指標，對藜蒿總黃酮的體外抗氧化能力進行評價。研究為藜蒿資源有效開發提供了合理的數據，為藜蒿總黃酮提取的工業化生產提供了具體的工藝參數。

1 材料與方法

整株野生藜蒿（采摘自江西省鄱陽湖附近）。蘆丁標準品（合肥博美生物科技有限責任公司）；無水乙醇（北京化學試劑有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、AlCl3·6H2O、HCl、NaOH（西隴科學股份有限公司）；DPPH（上?；晒I發展有限公司）。以上試劑均為分析純。

ES2000 型電子天平（天津市德安特傳感技術有限公司）；DHG-9015A 型電熱鼓風恒溫干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；DK-S26 型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；722N 可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；RE-522AA 旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；KL05A 型高速臺式冷凍離心機（凱特實驗儀器有限公司）。

1.3.1 黃酮標準液的制備

準確稱取蘆丁0.010 g，置于50 mL 容量瓶中，以60%乙醇溶解定容至刻度，取25 mL 定容后的溶液用蒸餾水稀釋至50 mL，配制成濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁對照品溶液。準確量取蘆丁標準液2、4、6、8、10 mL 分別加入5 支試管中，向每支試管中加入5 mL 30%乙醇溶液、0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻放置6 min，再加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，放置6 min，最后加入4 mL 4%氫氧化鈉溶液，蒸餾水稀釋至25 mL，放置25 min。在可見分光光度計上設定波長510 nm，測定各試管中溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標，溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線圖。

1.3.2 藜蒿總黃酮提取工藝

取整株藜蒿在鼓風干燥箱內60 ℃下烘干至恒重，超微粉碎后過80 目篩得到樣品粉末。準確稱取經處理后的藜蒿樣品粉末1.000 g 置于25 mL圓底燒瓶中，加入一定體積的70%乙醇溶液浸泡1 h 后，放入一定溫度恒溫水浴鍋中回流提取一定時間，得到的提取液用濾紙過濾定容至25 mL。在見分光光度計上設定波長510 nm，測定試管中溶液的吸光度。

1.3.3 藜蒿總黃酮得率的計算

利用線性回歸方程計算藜蒿中總黃酮得率：

式中：C 為樣品中黃酮的濃度（g/L）；V 為樣品提取液的體積（mL）；n 為樣品提取液的稀釋倍數；m 為藜蒿樣品干粉的質量（g）。總黃酮得率r 的單位為mg/g。

1.3.4 藜蒿總黃酮提取工藝優化

1.3.4.1 單因素試驗設計

在藜蒿粉末質量（1.000 g）不變的情況下，設置提取溫度、提取時間、液固比三個變量，研究其對藜蒿總黃酮提取率的影響。設液固比15 mL/g、提取時間1.5 h 為不變量，研究分析5 個不同提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）對藜蒿總黃酮提取率的影響；設液固比20 mL/g、提取溫度70 ℃為不變量，研究分析5 個不同提取時間（0.5、1、1.5、2、2.5 h）對藜蒿總黃酮提取率的影響；設提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h 為不變量，研究分析5 個不同液固比（10、15、20、25、30 mL/g）對藜蒿總黃酮提取率的影響。

1.3.4.2 正交試驗設計

通過單因素試驗，確定影響藜蒿總黃酮得率的主要因素和各因素參數范圍，選擇對得率影響較大的提取溫度、液固比和提取時間3 個因素設計正交試驗L9（33）。正交試驗因素水平見表1。通過正交試驗確定藜蒿總黃酮提取的最佳工藝組合。

表1 藜蒿總黃酮醇提法正交試驗因素水平

1.3.5 體外抗氧化活性試驗

1.3.5.1 總還原能力的測定

取上述優化條件下的提取物，減壓濃縮成稠膏，使用70%的乙醇溶解并稀釋，得濃度為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8 g/L 的黃酮溶液，使用相應濃度的VC 做對照試驗。參照李冬梅等[10]的方法，并做相應修改。取1%的鐵氰化鉀2.5 mL 與0.2 mol/L 的磷酸鹽緩沖溶液0.2 mL，加入待測樣品溶液，50 ℃恒溫放置30 min，加入2.5 mL 10%的三氯乙酸，離心取上清液1 mL，加入1 mL 的0.1% Fe Cl3、4 mL 蒸餾水混勻，靜置10 min，于700 nm 處測吸光度。

還原能力計算公式為 還原能力=A1-A2（2）其中，A1為樣品組吸光度；A2為樣品本底吸光度（以等體積蒸餾水代替FeCl3溶液）。1.3.5.2 清除OH 自由基能力的測定

參照田建華等[11]的方法，并做相應修改。取2 mmol/L FeSO4溶液5 mL，6 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液15 mL，再加入6 mmol/L H2O2溶液5 mL，搖勻混合。在37 ℃恒溫水浴15 min，以蒸餾水為參照，于517 nm 處測定吸光度，計算清除率：

OH 自由基清除率=(A0-A1)/A0×100% （3）式中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品溶液的吸光度。

1.3.5.3 清除DPPH 自由基能力的測定

參照董玉瑋等[12]的方法，并做相應調整。取不同濃度提取液3 mL，精確取0.4 mL/mg 的DPPH-乙醇溶液3 mL，試管暗置30 min，4000 r/min 離心10 min，使用無水乙醇做對照品試驗。取上清液于517 nm 處測吸光度，并計算清除率：

DPPH 自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%

（4）其中，A0為3 mL 無水乙醇+3 mL DPPH 溶液的吸光度；A1為3 mL 樣品溶液+3 mL DPPH 溶液的吸光度；A2為3 mL 樣品溶液+3 mL 無水乙醇的吸光度。

2 結果與分析

根據試驗設計方法，在波長510 nm 處測定溶液的吸光度。以吸光度為縱坐標（Y），溶液濃度（X）為橫坐標，繪制出標準曲線圖1。求出回歸方程：y=2.177x+0.0042，相關系數R2=0.999，說明蘆丁濃度與吸光度呈線性關系。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2.1 液固比對藜蒿總黃酮得率的影響

設置提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h、乙醇體積分數60%，以液固比為變量考察其對總黃酮得率的影響，結果如圖2 所示。由圖2 可得出，隨著液固比增大，總黃酮得率在10、15、20 mL/g 范圍內增高，在液固比為20 mL/g 時達到最大值，當液固比超過20 mL/g 時，總黃酮得率下降。原因可能是液固比較低時乙醇溶劑不足導致藜蒿黃酮提取不完全，而液固比較高時，乙醇溶劑過多影響藜蒿黃酮提取率。因此，20 mL/g 的液固比是藜蒿黃酮提取的最佳參數。

圖2 液固比對藜蒿總黃酮得率的影響

2.2.2 提取溫度對藜蒿總黃酮得率的影響

設置提取時間1.5 h、液固比15 mL/g、乙醇體積分數60%，在提取溫度50、60、70、80、90 ℃范圍內考察其對藜蒿總黃酮得率的影響，結果如圖3 所示。由圖3 可知，總黃酮得率隨提取溫度的變化而變化，在提取溫度為80 ℃時達到得率的最大值，此時提取溫度再升高，黃酮得率反而下降。原因可能是提取溫度升高，分子運動更加劇烈，增大了黃酮提取率，但提取溫度過高，破壞了分子結構導致藜蒿總黃酮提取率下降。所以，80 ℃的提取溫度是藜蒿黃酮提取的最佳條件。

圖3 提取溫度對藜蒿總黃酮得率的影響

2.2.3 提取時間對藜蒿總黃酮得率的影響

設置提取溫度70 ℃、液固比15 mL/g、乙醇體積分數60%，在0.5-2.5 h 范圍內考察提取時間對藜蒿黃酮提取率的影響，結果如圖4 所示。由圖4 可知，在一定范圍內藜蒿總黃酮得率隨提取時間而變化，并在提取時間為1.5 時達到最大值。原因可能是提取時間過短，藜蒿黃酮溶出過少導致總黃酮得率低，而提取時間過長，藜蒿中的總黃酮會發生熱分解損失，藜蒿黃酮提取率下降。因此，1.5 h 的提取時間是藜蒿黃酮提取的最佳條件。

圖4 提取時間對藜蒿總黃酮得率的影響

各因素對藜蒿總黃酮得率的影響并非單一線性，實際上總黃酮得率受到提取溫度、提取時間、液固比、乙醇體積分數因素的交叉影響，而乙醇體積分數因素對藜蒿總黃酮得率影響較小，因此根據單因素考察試驗結果，選取提取溫度、提取時間、液固比三個因素設置正交試驗的因素水平，對藜蒿總黃酮的提取工藝進行進一步的優化。正交試驗結果和方差分析如表2、表3 所示。由表3 可知，各因素對提取藜蒿總黃酮的影響不同，在本研究中提取溫度影響最大，其次是液固比，最后是提取時間。藜蒿總黃酮的最佳提取參數組合為A3B2C2，即最佳提取工藝條件是提取溫度80 ℃、液固比20 mL/g、提取時間1.5 h。

表2 藜蒿總黃酮醇提法正交試驗結果

用正交設計助手軟件對試驗結果進行方差分析，P＜0.05 認為有顯著性差異，P＜0.01 則認為有極顯著性差異。由表3 可知，因素A 在P＜0.01水平上有極顯著性差異，因素B 和因素C 在P＜0.05 水平上有顯著性差異。如表4，為驗證試驗結果，考察預測結果的可靠性，在優化的工藝參數下（提取溫度80 ℃、液固比20 mL/g、提取時間1.5 h、乙醇體積分數60%），進行三次平行驗證試驗，所得藜蒿總黃酮平均得率為38.32 mg/g。

表3 藜蒿總黃酮醇提法正交實驗方差分析

表4 驗證實驗結果

2.4.1 藜蒿總黃酮總還原能力

測定藜蒿總黃酮和VC 的總還原能力結果見圖5。隨著黃酮濃度和VC 濃度的增加，還原能力都出現較為明顯的上升，當VC 的濃度達到0.8 g/L 時，吸光度值達到最大，為1.040；而總黃酮的濃度為0.8 g/L 時，吸光度為0.971。藜蒿總黃酮總還原能力隨著總黃酮濃度的增加而提高，與同濃度VC 的還原能力相近。由此證明了藜蒿總黃酮具有一定的還原能力。

圖5 不同濃度的藜蒿總黃酮總還原能力

2.4.2 藜蒿總黃酮對OH 自由基清除能力

由圖6 可知，在總黃酮濃度為0.1-0.8 g/L 范圍內時，藜蒿黃酮對OH 自由基有一定的清除作用，清除能力隨著黃酮濃度的增加而增強，且略高于VC 的清除能力，當濃度達到0.8 g/L 時，黃酮對OH 自由基的清除率為91.12%，VC 對OH 自由基的清除率為90.68%，二者清除能力較為接近。結果表明藜蒿總黃酮具有良好的清除OH 自由基的能力。

圖6 藜蒿總黃酮對OH 自由基的清除率

2.4.3 藜蒿總黃酮對DPPH 自由基清除能力

圖7 為藜蒿黃酮和VC 清除DPPH 自由基能力曲線。由圖7 可知，藜蒿黃酮在濃度0.1-0.8 g/L 范圍內，對DPPH 自由基的清除能力隨著濃度的增加有所提高，在0.1-0.3 g/L 濃度范圍內，曲線較平緩，在0.3-0.7 g/L 濃度范圍內，清除能力增加較快，在濃度達到0.8 g/L 時，黃酮對DPPH自由基的的清除率為77.32%，VC 對DPPH 自由基的的清除率為86.44%，黃酮的清除能力略低于VC。說明藜蒿總黃酮有一定的清除DPPH 自由基的能力。

圖7 藜蒿總黃酮對DPPH 自由基的清除率

3 討論與結論

實驗中通過單因素的考察與正交試驗分析，發現提取溫度對藜蒿總黃酮的提取影響較大。乙醇的沸點為78.31 ℃，因此采用乙醇為溶劑的萃取法的適宜溫度應在乙醇的沸點左右。本實驗得出最佳提取溫度為80 ℃，這與其他植物總黃酮提取溫度相近[9-11]。楊凌君等[12]同樣采用醇提法研究了藜蒿葉中總黃酮的提取工藝優化，得到的最佳工藝參數為液固比15 mL/g、提取溫度70 ℃、提取時間1.5 h，與本研究的結果相接近。此外，抗氧化活性結果顯示：藜蒿整株提取的總黃酮對DPPH、OH 自由基具有良好的清除能力，并且具有一定的總還原能力，謝星等[13]和Zhang 等[14]的研究結果也證明了這一點。

藜蒿為藥食兩用新資源，富含多種對人體健康有利的營養活性成分，有望用作天然綠色的抗氧化劑。因此，有必要進一步研究其抗氧化的作用機制以及提取工藝，為藜蒿的開發利用提供依據。