替米考星體外抑制藍耳病病毒復制的研究

文│譚濤 梅小偉［禮藍（上海）動物保健有限公司］

李燕華（揚州大學）

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）俗稱“藍耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）感染導致的豬傳染性病，其典型臨床表現為生長豬呼吸道疾病及母豬繁殖障礙性疾病等。PRRS是當前僅次于非洲豬瘟最重要的豬傳染病之一，對我國養豬業產生巨大威脅。PRRSV是一類有囊膜的單股正鏈RNA病毒，屬于套式病毒目動脈炎病毒科，包含PRRSV 2型（北美型）和PRRSV 1型（歐洲型）兩個基因型。中國境內流行的PRRSV毒株主要是北美型。目前在我國流行的優勢毒株為HP-PRRSV、類NADC30-PRRSV毒株及其重組毒株。接種疫苗是當前防控PRRS的重要手段，由于PRRSV基因組快速變異，臨床上不斷有新的變異毒株出現，現有的PRRS疫苗對變異毒株的保護力有限，甚至會出現重組毒株和疫苗毒力返強的情況。

目前尚無針對PRRSV的特異性抗病毒藥物，泰勇是禮藍動物保健有限公司生產的替米考星預混劑，其主要抑菌活性成分是替米考星（含量為20%），臨床上用于治療豬胸膜肺炎，放線桿菌、巴氏桿菌、支原體等病原引起的感染。有研究表明，泰勇的主要活性成分替米考星可以抑制PRRSV在巨噬細胞中的復制，減輕藍耳病的臨床癥狀，改善豬只體增重。本研究在細胞感染水平上評估泰勇對我國流行的類NADC30（NL-1207）和HP-PRRSV（BLC-2）毒株感染的抑制作用。

一、材料與方法

1.細胞與病毒。豬的肺泡巨噬細胞取自3～4周齡的PRRSV抗原和抗體陰性仔豬的肺臟；本研究使用的PRRSV毒株為我國當前流行的L1譜系（類NADC30毒株NL1207）和L8譜系（HP-PRRSV毒株BLC-2）臨床分離毒株（圖1）。

2.主要試劑。泰勇（20%替米考星預混劑），RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（諾唯贊），HiScriptRII One Step qRT-PCR Probe Kit（諾維贊），CCK-8 Cell Counting Kit（諾唯贊），PRRSV RT-qPCR檢測的引物與探針。

3.泰勇溶解與定量。將500毫克泰勇加入到10毫升分析純的甲醇中，4℃過夜，旋轉混勻后在4℃的冷凍離心機中離心沉淀不可溶的部分（暗黃色的外衣），將上清液通過細菌濾器（0.22微米孔徑），分裝后凍存于-20℃備用。此溶液的濃度為10毫克/毫升。

4.泰勇對病毒懸液中PRRSV的作用。將一定濃度的泰勇（0、10、20、40、80微克/毫升）與PRRSV（1 MOI）病毒液混合，室溫處理1小時后感染肺泡巨噬細胞。感染后2小時去除病毒和藥物上清，PBS漂洗兩次，24小時后收集病毒上清。通過RT-qPCR法檢測病毒上清中的病毒基因組拷貝數，比較藥物處理組與對照組病毒復制情況，判定泰勇對PRRSV是否有直接殺滅作用。

5.泰勇對肺泡巨噬細胞內PRRSV的作用。將一定濃度的泰勇（0、10、20、40、80微克/毫升）預先處理肺泡巨噬細胞，再接種PRRSV（1 MOI）。感染2小時后去除病毒上清液，漂洗未結合的病毒，加入與前處理相同濃度的泰勇。在細胞培養箱中孵育24小時后收集病毒上清。通過RT-qPCR檢測病毒上清中的病毒基因組拷貝數，比較藥物處理組與對照組病毒的復制情況，判定泰勇對PRRSV感染的抑制作用。

6.統計分析。運用GraphPad Prism 8.0軟件中的ANOVA分析方法對數據進行生物統計學分析，P＜0.05表示組間差異顯著。

◎圖3 泰勇抑制PRRSV（類NADC30毒株NL1207和小時P-PRRSV毒株BLC-2）在肺泡巨噬細胞中的復制

二、試驗結果

1.泰勇的抗病毒活性成分溶于甲醇但不能溶于水和乙醇。泰勇為顆粒狀的替米考星預混劑，為了便于在細胞水平上進行抗病毒試驗，本試驗嘗試了超純水、乙醇和甲醇等溶解其抗病毒成分。運用這3種溶劑，分別配制了10毫克/毫升的泰勇浸出液。PRRSV（NL1207）抗病毒試驗結果表明，溶于甲醇的泰勇浸出液能顯著降低PRRSV感染后細胞上清中的病毒基因組拷貝數；水和乙醇溶解泰勇的能力較弱。因此，本研究選擇甲醇為溶劑配制泰勇浸出液。

2.泰勇不能直接滅活PRRSV。當前我國流行的PRRSV毒株的遺傳多樣性非常復雜，主要為類NADC30毒株和HP-PRRSV毒株。本研究使用類NADC30毒株NL1207和HP-PRRSV毒株BLC-2用于研究泰勇的抗病毒作用。我們首先測試了泰勇是否能直接滅活NL1207和BLC-2兩個毒株。將不同濃度的泰勇與PRRSV（1 MOI）混合，室溫孵育1小時，感染肺泡巨噬細胞，收集感染24小時后的病毒培養物。RT-qPCR檢測結果表明，泰勇處理后感染肺泡巨噬細胞的病毒產量與對照組無顯著差異（圖2），與先前研究結果一致，泰勇不能直接滅活PRRSV。

3.泰勇抑制PRRSV在肺泡巨噬細胞中的復制。泰勇浸出液可抑制PRRSV在豬肺泡巨噬細胞中的復制。收集感染24小時后的培養物，并提取RNA，RT-qPCR檢測結果表明，泰勇的濃度大于20微克/毫升時，類NADC30毒株NL1207和HP-PRRSV毒株BLC-2在肺泡巨噬細胞上的復制被顯著抑制（圖3）。當泰勇的濃度為80微克/毫升時，對NL1207和BLC-2毒株抑制效果最明顯，抑制倍數分別為8.3和4。以上結果顯示，泰勇能間接抑制PRRSV在豬肺泡巨噬細胞中的復制。

三、結論與討論

該研究評價了替米考星（泰勇）對我國當前流行PRRSV毒株的抑制作用?？共《驹囼灲Y果表明，泰勇顯著抑制不同譜系PRRSV在豬肺泡巨噬細胞中的復制，但不具有直接滅活PRRSV的能力。也就是說，替米考星（泰勇）是通過肺泡巨噬細胞間接抑制PRRSV復制。

根據國外報道，替米考星的抗病毒機理是升高巨噬細胞內溶酶體的pH，從而導致PRRSV的復制速度減慢，替米考星自身帶有堿性基團，使其容易向酸性溶酶體聚集，減弱PRRSV的脫殼反應，降低復制速度。

另外，替米考星還可調節炎癥因子表達，減輕炎癥反應，降低肺部損傷。替米考星作為大環內酯類抗生素具有抗菌作用，這使得豬群在PRRS感染后繼發的細菌性疾病也可得以控制，臨床上替米考星可以和磺胺類等藥物共同使用，降低感染豬群死亡率，有效降低PRRS和繼發感染造成的經濟損失。