精液質量分析系統的應用技巧

文│朱寬峰（北京田園奧瑞生物科技有限公司）

計算機輔助精液質量分析系統（computer assisted semen analysis system，CASAS）是使用計算機技術進行精液質量分析的儀器，正確使用可以有效降低人工檢測的誤差大、主觀性強的缺點。但很多技術員甚至科研人員對CASAS不太了解，存在一些誤解，筆者根據對CASAS研發與使用的經驗對CASAS做一個介紹，期望能讓大家對此有更多的認識。

一、CASAS的原理

1.CASAS系統組成。包括硬件和軟件兩部分，其中硬件主要包括顯微鏡、高清高速攝像頭、計算機等部分，軟件包括相機驅動軟件、精液質量分析軟件等。

2.原理。顯微鏡成的像被高清攝像頭采集，經過計算機處理后識別出精子，并構建精子軌跡，進而計算出精子各項運動參數，并輸出各項監測指標。

（1）精子識別。精液樣品，更為通常雜質比較少，最簡單的識別方法就是將圖像中一定大小范圍的亮斑或者暗斑識別出來即可，更為精確的還需要計算斑塊的長度寬度等信息。有一些智能算法則是基于訓練模型，先通過人工訓練，積累數據，優化模型從而對實際樣本進行檢測。

（2）構建軌跡。相機獲取的是一系列有時間順序的靜態圖像，通過一定的算法將這些圖像中的精子進行一一匹配，從而構建出所有精子的運動軌跡。

（3）運動參數定義。最基礎的運動參數定義見表1，對應的示意圖見下圖。根據這些參數的定義可以計算出各種運動參數，并為活力、活率等指標的計算做基礎。

表1 精子運動參數表

（4）主要指標的定義。主要的指標包括密度、活力、活率，以及其他一些輔助的指標。

活力是指前向精子占總精子的百分比，活力＝視野中前向精子數/視野總精子數×100%。

活率是指活動精子占總精子的百分比，活率＝視野中活動精子數/視野總精子數×100%。

密度是指單位體積的精子數，密度＝視野精子數/視野體積＝視野精子數/（視野長度×視野寬度×腔室厚度）。

一般檢測時多個視野的平均值或者匯總數據，因此還需要對上述數據求平均值。

二、引起檢測誤差的因素

1.成像質量。所有的分析基礎都建立在成像的基礎上，成像不清晰的話會導致子識別困難。從樣品到軟件識別的圖像，需要經過顯微鏡物鏡成像、攝像頭采集、圖像處理等多個步驟，每一個步驟有問題都會影響圖像質量。

（1）顯微鏡。對于顯微鏡成像來說，光源的穩定性和均勻性、鏡片有無上有無灰塵、鏡頭是否污染、蓋玻片厚度是否與鏡頭匹配都會影響成像質量。不同類型的顯微鏡成像清晰度也不一樣，是否正確使用也是關鍵。對于普通生物顯微鏡來說，可變光闌是否調到合適位置其成像質量也會有很大差異。對于相差顯微鏡來說，聚光鏡是否調到位、相差環是否對中、相差片與物鏡是否對應都能影響顯微鏡的成像質量。

（2）玻片。對于玻片來說，玻片潔凈度是嚴重影響成像質量的一個因素，臟的玻片會使精子和臟物之間難以區分。蓋玻片厚度會影響光程，因而影響成像，一般物鏡上都會有標注，通常是0.7毫米厚的蓋玻片最適宜。

玻片腔室厚度過大會導致視野有多層精子，精子運動表現為明顯的三維運動，當精子不處于焦平面時成像不清晰，從而影響精子識別。而當精子在不同層之間來回穿梭時會導致精子跟蹤失敗。

（3）攝像頭與相機驅動。對于攝像頭來說，分辨率和信噪比是十分重要的參數。分辨率越高，信噪比越高，則成像越清晰，越有利于精子識別。但過高分辨率會導致圖像數據量過大，增大計算機處理工作量，降低分析速率，一般來說，在物鏡放大基礎上，相機的分辨率應該達到1微米/像素以內，否則看不見精子尾部。曝光時間也會影響成像質量，曝光時間太短，則獲得的信息不足，圖像模糊；曝光時間過長，由于精子是運動的，會導致精子重影，也會使圖像模糊。

一般來說，應該使顯微鏡光照盡量強一些，以盡量縮短曝光時間。

通過對相機參數進行合理調整和設置，或者專門對采集到的數據進行增強和降噪，都能夠提升圖像質量。

2.震動。由于精子本身尺寸只有幾微米，實驗臺幾微米的震動都會明顯影響精子的運動軌跡，導致本來靜止的精子表現出活動跡象，而活動精子VCL也會略微增大。因此放置顯微鏡的操作臺應該平穩防震。

3.溫度。一定范圍內，溫度越高精子活躍度越高。但是由于載物臺中間要留出光通道，中間有空槽，恒溫載物臺在這個位置溫度也會比其他位置低。載玻片越薄，經載玻片傳導的熱量越少，中間的溫度也就越低。因此應該保證載物臺中央溫度達到規定的37℃～38℃。

4.精子面密度。面密度是指單位面積的精子數，影響面密度的因素包括精子密度和腔室厚度。密度越大、腔室厚度越大，則精子面密度越大，精子之間的距離也就越小。精子間距越小，則精子碰撞的概率越大，死精子越有可能被當成活精子，精子軌跡跟蹤失誤的概率也越大。同時精子間距越小，當精子間距小于精子在兩幀時間間隔內的運動距離時，精子就很可能匹配錯誤。

5.幀率。幀率是攝像頭指每秒鐘獲取的圖像數量。幀率受限于曝光時間和攝像頭的性能。在攝像頭允許范圍內，最大幀率＝1秒/曝光時間。幀率越高，則相鄰兩幀中精子移動的距離就越小，越不容易將兩個相鄰的精子錯配。

6.分析時長。精子運動軌跡是彎彎曲曲的，沒有完全呈直線運動的。分析時間越長，則精子軌跡呈現的越全面，時間越短越不容易反映精子的實際軌跡。對于圓弧形運動或者轉圈的精子來說尤其明顯。當時間很短時，精子近似呈直線運動，隨著時間延長，圓弧越來越明顯，直線性越來越低，直到最后呈圓圈狀。不同的軌跡計算出來的參數不同，也就影響到活力和活率的判定。

分析時長并不是越長越好，分析時間越長，精子軌跡交叉的概率越大，出錯的概率也越大。并且分析時間越長意味著需要分析的幀數就越多，數據處理量越大，分析速率就越慢。

7.算法。各種參數和指標的定義，需要明確為計算公式和判定邏輯才能使計算機能夠執行，但是具體參數和指標的定義公式、精子識別算法、跟蹤算法等多個方面的內容細節都會有多種選擇，并影響到結果。

（1）參數定義公式。VCL、VSL和MAD定義比較明確，計算方法基本一致，LIN＝VSL/VCL，定義也因此是明確的，但這些指標受幀率和分析時長影響。

但VAP是指平均路徑速率，具體采用哪種平均值或者擬合公式來代表平均路徑各個廠家都不一樣，并沒有統一的計算公式。ALH、BCF、STR、WOB等參數都是在平均路徑的基礎上計算的，由于平均路徑的計算方法沒有統一的公式，這些參數也就沒有統一的計算公式。并且VAP、ALH、BCF、STR、WOB也受幀率和分析時長的影響。

（2）指標定義。對于目測方法來說，前向精子是綜合多個信息來判定的，不僅僅是精子呈前向運動，還有是不是主動運動而不是飄動的。但是怎樣的精子算前向的，每個人都有自己的判定標準，并且是個模糊的標準。對于計算機就必須是明確的。

對于活力，可以從運動軌跡的曲率、線性、前向性、平均移動角度等一個或者多個方面進行判定。但是具體選擇哪一個作為依據并沒有標準。理論上這些指標都是可行的，并且都是相關的。

對于活率，精子運動到什么程度算活動的，以VCL、VSL還是VAP作為依據也是沒有標準的，理論上這些指標都是可行的，并且也是相關的。

對于視野邊緣的精子，肯定是有精子游入，也有精子游出，這些精子會改變視野中的精子數量，并且都是運動精子，對活力和活率有一定影響，因此是否考慮這些邊緣位置的精子就會導致一定的誤差。

對于密度，視野長度和寬度一般誤差很小，但是腔室厚度誤差比較大。對于標稱10微米厚的玻片來說，如果加工誤差1微米，則檢測的密度將會因此產生10%的誤差。對于標稱20微米厚的玻片來說，如果加工誤差1微米，則檢測的密度也會因此產生5%的誤差。

（3）精子識別。視野邊緣的精子由于顯示不全，會導致精子識別失誤。這個概率為邊緣區占總視野的面積比例，與精子大小以及視野總面積有關。精子越小，視野越大，則邊緣精子識別誤差越小。

雜質越多、圖像質量越差，則識別出錯的概率越大，識別誤差也就越大。

（4）精子跟蹤。最簡單的跟蹤方法是最小鄰域算法，也就是將后一幀圖像中與上一幀距離最近的精子認為是同一個精子，這樣就可以將全部圖像中的精子軌跡建立起來。很顯然，這種算法沒有考慮精子運動方向和路徑交叉的情況。

由于精子運動不規則，構建精子實際路徑，需要預測精子的運動方向，對精子運動方向有一定限制。在精子軌跡交叉時，精子圖像重疊，此時還需要對重疊圖像進行分割，否則會導致精子數量偏低以及軌跡斷掉。

幀率越低，精子在幀與幀之間運動的距離就長，越容易被當成2個精子。分析時長越長，軌跡交叉的概率越大。因此幀率越低，分析時長越長，跟蹤的誤差就越大。

即使沒有跟蹤失誤，要構建完整的軌跡最少需要幾十幀的圖像，在這段時間內肯定有精子游出和游入視野，而這兩部分的精子都不會有完整的軌跡。如果采納不完整軌跡的結果，則會有計算誤差。如果不采納不完整軌跡，則運動精子尤其是快速運動精子的比例將會降低。視野越小，精子運動越快，分析時長越長，這個影響就會越大。

◎圖 運動參數定義示意圖

三、正確使用CASAS

不同廠家的CASAS，由于具體參數各不相同，不具備嚴格意義上的可比性。同一廠家的CASAS，由于參數設置不同得出的結論也不具備嚴格意義上的可比性。對于這些結果，由于都是對活力、活率進行檢測，但是方法不同，可以認為它們是有相關性的不同指標，都能反映出精子的運動狀態。

要正確使用CASAS，則應該熟悉CASAS的結構和原理，并掌握顯微鏡的調試使用方法、軟件各項參數調好后盡量不動，起碼不修改對結果有重要影響的幀率、分析時長、判定參數及其閾值。即便要修改，也應該在一個實驗全部結束以后。