布魯氏菌L7/L12和GroES真核表達載體的構(gòu)建及免疫效果分析

周詩淼，于秀劍，冀夢瑤，肖麗榮，張志強，史秋梅，吳同壘

(河北科技師范學(xué)院動物科技學(xué)院河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點試驗室，河北 秦皇島，066600)

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人獸共患傳染病，給牛羊養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大經(jīng)濟損失，同時嚴(yán)重威脅人類健康[1～3]。疫苗免疫是預(yù)防布魯氏菌病較為有效的方法，商品化的布魯氏菌疫苗有A19，S2，Rev1，M5和RB51等，均為弱毒疫苗，但是存在安全性不足的缺點。例如，A19可導(dǎo)致懷孕動物流產(chǎn)，并存在排毒風(fēng)險，且大都能夠感染人并引起一過性疾病[4～6]。DNA 疫苗安全性高，且現(xiàn)有研究顯示某些基因能夠刺激機體產(chǎn)生較強的保護力，逐漸得到人們的重視[7]。

有研究顯示，基于布魯氏菌L7/L12基因的DNA疫苗能夠產(chǎn)生良好的保護作用[6,8]。GroES是熱休克蛋白hsp60家族的輔助蛋白，可以激活宿主免疫反應(yīng)，同時參與抗原呈遞，增強宿主免疫應(yīng)答水平[9]。筆者期望通過構(gòu)建L7/L12和GroES雙基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染293T細胞，驗證其表達，并免疫小鼠，評價其免疫效果，為布魯氏菌DNA疫苗的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 菌株及質(zhì)粒

B.abortus2308滅活菌株由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所惠贈；DH5α，BL21(DE3)菌株購自寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒pET32a，pcDNA3.1和293T人胚腎細胞由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)吳清民教授惠贈；BALB/C小鼠，由河北科技師范學(xué)院動物傳染病實驗室自繁自養(yǎng)。

1.2 主要試劑

Ni-瓊脂糖凝膠，His標(biāo)簽鼠源單克隆抗體和HRP-羊抗鼠IgG，無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；ConA，DMSO，MTT，紅細胞裂解液，SDS-PAGE 及Western blot相關(guān)試劑購自北京索萊寶生物科技有限公司。

1.3 重組表達載體和表達菌株的構(gòu)建

提取B.abortus2308基因組DNA，通過PCR獲得L7/L12和GroES的融合基因片段。引物信息見表1，其中引物L(fēng)G-1～LG-4(重疊PCR技術(shù))用于構(gòu)建原核表達載體，引物L(fēng)G-5～LG-8(重疊PCR技術(shù))用于構(gòu)建真核表達載體。

分別進行PCR和重疊PCR擴增，擴增產(chǎn)物與質(zhì)粒pET32a，pcDNA3.1進行雙酶切、連接和轉(zhuǎn)化，涂布Amp平板培養(yǎng)過夜。挑取單菌落使用相應(yīng)引物(T7和S-tag引物，pcDNA3.1-F和pcDNA3.1-R)進行PCR鑒定，陽性菌株提取質(zhì)粒、雙酶切鑒定，送生工測序。鑒定無誤的重組質(zhì)粒分別命名為pET32a-LG和pcDNA3.1-LG。

表1 引物信息

1.4 重組蛋白的誘導(dǎo)表達、驗證及純化

將重組質(zhì)粒pET32a-LG轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21中，IPTG誘導(dǎo)表達后，進行SDS-PAGE和Western blot分析，驗證其表達。

誘導(dǎo)表達后，超聲裂解菌體，離心分離上清和沉淀，分別進行SDS-PAGE，對表達產(chǎn)物形式進行分析；對表達產(chǎn)物進行Ni柱純化，并進行SDS-PAGE驗證。

1.5 重組蛋白的鼠源多克隆抗體的制備及鑒定

首次免疫使用弗氏完全佐劑乳化重組蛋白，在小鼠背部皮下多點注射免疫小鼠，劑量為100 μɡ/只，2周后二免，使用弗氏不完全佐劑乳化蛋白，劑量為50 μɡ/只；1周后三免，方法同二免；1周后加強免疫，不使用佐劑，劑量為100 μɡ/只，腹腔注射；1周后禁食1 d，次日取血、分離血清。取重組蛋白進行SDS-PAGE和轉(zhuǎn)膜，使用制備的鼠血清作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠多克隆抗體作為二抗進行Western blot分析。

選擇蛋白濃度100 ng/孔包被培養(yǎng)板，對血清進行倍比稀釋，二抗使用1∶5 000稀釋的HRP-羊抗鼠IgG，測定血清抗體滴度。

1.6 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG的瞬時轉(zhuǎn)染

采用無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染的前1 d，在2塊6孔培養(yǎng)板中接種2 mL 293T細胞于單孔中，每孔約2×105個細胞，使轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞融合度能夠達到50%～80%。在1.5 mL離心管中將2 μɡ的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒溶于200 μL jetPRIME?buffer，旋渦震蕩10 s；然后加入 4 μL jetPRIME?reagent，旋渦震蕩10 s，室溫孵育10 min；然后將細胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)基棄去，添加無血清培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物輕柔加入到單孔培養(yǎng)基中，充分混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，吸棄培養(yǎng)基，換為血清體積分?jǐn)?shù)為10%的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，取其中一塊6孔板進行間接免疫熒光；另一塊6孔板培養(yǎng)48 h后，收集293T細胞用于Western blot檢測。

1.7 真核表達產(chǎn)物的間接免疫熒光鑒定

取轉(zhuǎn)染后的293T 細胞，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌3遍；20 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，用PBS洗滌3遍；10 g/L Triton X-100，室溫下作用15 min，用PBS洗滌3次；20 g/L BSA，4 ℃封閉過夜，PBS洗滌3遍；使用pET32a-LG和pcDNA3.1-LG抗血清，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次；加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗，37 ℃避光孵育1 h；PBS洗滌6次，加入PBST 1 mL，熒光顯微鏡下觀察，并拍照保存。

1.8 真核表達產(chǎn)物的Western blot鑒定

取出轉(zhuǎn)染的細胞置于冰上，用冰冷的PBS洗滌3次，加入蛋白上樣緩沖液，收獲細胞至1.5 mL EP管中，煮沸15 min；4 ℃，14 000 r/min離心10 min，取上清即為蛋白樣品，western blot分析表達情況。

1.9 動物免疫

將BALB/c小鼠分為3組，每組5只，前兩組分別免疫重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒，劑量為100 μg/只，免疫方式為腿部肌肉注射；對照組肌注等體積PBS。首次免疫后，在1周和2周時加強免疫，劑量和方法同首次免疫。首次免疫后每間隔7 d，隨機取3只小鼠采血，收集血清，-20 ℃保存，共采血3次。每次采血后，處死小鼠，分離脾細胞，進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗。

1.10 血清抗體滴度檢測

采取間接ELISA法對血清抗體滴度進行檢測，以純化后的pET32a-LG和pcDNA3.1-LG重組蛋白為抗原(200 ng/孔)進行包被，小鼠血清為一抗(稀釋倍數(shù)為1∶50)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為二抗(稀釋倍數(shù)1∶5 000)，測定OD450。

1.11 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗

取處死小鼠脾臟，制備脾細胞懸液，注意使用紅細胞裂解液裂解紅細胞，PBS洗滌后，使用細胞培養(yǎng)基重懸細胞。細胞以105/孔鋪96孔板，每只小鼠脾細胞鋪9孔，其中1～3孔加入11 μL純化透析處理的LG重組蛋白(5 μg/mL)，4～6孔加入11 μL 細胞培養(yǎng)液，作為未刺激組；7～9孔ConA稀釋到5 μg/mL加入11 μL，作為ConA刺激組；另往10～12孔加入11 μL 1640培養(yǎng)液，作為無細胞對照組。作用72 h后，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后往孔中加入Formazan溶解液，混勻后培養(yǎng)4 h，測定OD570。計算刺激指數(shù)=(試驗組OD570均值-無細胞對照組的OD570均值)/(未刺激組的OD570均值-無細胞對照組的OD570均值)。

1: L7/L12-GroES; 2:GroES; 3: L7/L12; M: DL2000 Plus DNA Marker圖1 L7/L12和GroES基因PCR擴增

2 結(jié) 果

2.1 LG基因的PCR擴增

用牛種布魯氏菌2308基因組DNA為模板，通過PCR獲得L7/L12和GroES融合基因片段，實驗結(jié)果表明，成功連接L7/L12和GroES兩基因(圖1)。

2.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達、驗證和純化

將重組質(zhì)粒pET32a-LG轉(zhuǎn)化表達菌株BL21后誘導(dǎo)表達后SDS-PAGE，條帶大小符合預(yù)期(圖2A)。為了進一步驗證分泌蛋白表達，對融合蛋白進行針對表達標(biāo)簽His的Western blot鑒定，進一步證明目的蛋白獲得了表達(圖2B)。

對蛋白表達形式進行分析，實驗結(jié)果表明，重組蛋白主要為包涵體表達(圖2C)。對表達產(chǎn)物進行包涵體表達純化，并進行蛋白垂直電泳分析，得到了純度較高的融合表達蛋白(圖2D)。

2.3 多克隆抗體的Western blot驗證

小鼠眼球采血后離心收集血清，將分離到的血清作為一抗，LG原核蛋白作為抗原進行Western blot驗證。結(jié)果表明，多抗制備成功(圖3)。經(jīng)過ELISA測定，血清稀釋度1∶15 000時，P/N值仍大于2.1，因此確定該血清的抗體效價為15 000。

2.4 間接免疫熒光檢測pcDNA3.1-LG在293T細胞中的表達

利用鼠源性pET32a-LG蛋白的多抗，對用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的293T細胞24 h后進行免疫熒光檢測。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LG重組質(zhì)粒的293T 細胞中，可以看到特異綠色熒光，可見pcDNA3.1-LG重組質(zhì)粒能在293T 細胞中獲得表達(圖4)。

2.5 Western blot分析pcDNA3.1-LG在293T細胞中的表達

Western blot分析結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG的293T細胞中，可以檢測到大小約為48 ku的蛋白質(zhì)條帶；而在轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒的293T細胞中，未檢測到相應(yīng)的目的條帶(圖5)。

A：SDS-PAGE分析； B：Western blot驗證； C：表達形式分析； D：蛋白純化圖2 重組蛋白表達與純化

LG：pET32a-LG；空載：pET32a 圖4 間接免疫熒光驗證蛋白在 圖3 多抗的制備及驗證 93T細胞中的表達

2.6 免疫效果評價

2.6.1小鼠血清抗體水平檢測 采用ELISA方法對免疫后的小鼠進行血清抗體檢測，結(jié)果顯示，免疫重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG后的抗體水平高于空質(zhì)粒組和PBS組(圖6)。

2.6.2淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗 利用MTT法對脾細胞進行淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗，測定OD570，計算刺激指數(shù)，以試驗組刺激指數(shù)/未刺激組刺激指數(shù)為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)作圖。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG免疫組的刺激指數(shù)高于未刺激組和空質(zhì)粒組(圖7)。

LG:pcDNA3.1-LG；空載：pcDNA3.1 圖5 Western blot驗證蛋白在293T細胞中的表達 圖6 ELISA方法測定免疫小鼠血清抗體水平 圖7 淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗測定細胞免疫水平(MTT法)

3 討 論

布魯氏菌病是世界上流行最為廣泛和危害最為嚴(yán)重的人畜共患疾病之一，最為有效的防控手段為疫苗免疫[6,10～12]。最廣泛使用的疫苗是減毒疫苗，盡管它的使用在布魯氏菌病的預(yù)防和治療中起著重要作用，但這些疫苗存在一些明顯的缺點，例如安全性不足、有排毒性風(fēng)險、對人具有致病性等[3,5,13]。大量研究證明，DNA疫苗能夠引起良好的體液和細胞免疫，為布魯氏菌疫苗開發(fā)提供了重要思路和方向[4,7,14,15]。

本次研究利用真核載體pcDNA3.1構(gòu)建了重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細胞驗證重組蛋白的表達，并免疫動物后測定體液和細胞免疫水平，結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒具有良好的免疫效果。

布魯氏菌Cu/Zn SOD是較早被研究用于DNA疫苗的靶點基因，取得了一定的免疫保護效果。隨著研究深入，大量的靶基因被用于布魯氏菌DNA疫苗的構(gòu)建，例如BSP31，L7/L12，BvrR，GroES等基因[14,16～18]。由于單一基因構(gòu)建的DNA疫苗免疫保護力不足，本次研究選擇L7/L12和GroES進行融合表在載體構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染細胞，驗證其表達，以期獲得更好的免疫力。

經(jīng)典觀點認為布魯氏菌的特異性抗體不能幫助機體抵御該菌感染，但近年來的研究顯示，機體產(chǎn)生的某些抗體對該菌具有明顯的調(diào)理作用，因此，核酸疫苗刺激機體產(chǎn)生的抗體水平在一定程度上顯示其免疫保護力[19]。本次研究中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LG能夠刺激機體產(chǎn)生特異性抗體，可能參與機體對布魯氏菌的抵御作用。同時，利用淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗證明，該重組質(zhì)粒能夠刺激機體產(chǎn)生良好的細胞免疫力。

綜上所述，本次研究構(gòu)建了L7/L12和GroES的融合表達真核質(zhì)粒，免疫小鼠后，機體產(chǎn)生了良好的體液和細胞免疫力。