致冬季蛋雞呼吸道傳染病的病原檢測與分析

張海龍，何云鳳，黨儒堯，陳 玥，李佩國，李蘊玉

(河北科技師范學院 河北省預防獸醫學重點實驗室，河北 秦皇島，066600)

雞呼吸道傳染病大多是由一種病原體單獨感染或多種病原體混合感染引起的，在寒冷的冬春季節最常發生，可危害所有日齡的雞，臨床表現為咳嗽，噴嚏等呼吸道癥狀，發病率和死亡率較高[1]，病程較長，難于治愈，成為危害我國養雞業生產較為嚴重的疾病[2]。在生產實踐中，當雞群出現呼吸道癥狀后，往往不經確診就大劑量使用抗生素、抗病毒藥，存在藥物品種、劑量和使用療程的盲目性，不僅增加了生產成本，還破壞了腸道正常菌群，產生耐藥菌株，甚至導致二重感染，給診斷和治療帶來一定的困難[3]。2020年11月17日，河北省秦皇島市撫寧區某養殖場飼養的8 000只175日齡的海蘭褐蛋雞出現精神沉郁，采食量減少，咳嗽，氣喘，有啰音，每天死亡10余只，為了確定引起蛋雞呼吸道疾病的病原，進行了病原檢查，現將結果報告如下：

1.1 病料來源

2020年11月17日，河北省秦皇島市撫寧區某蛋雞養殖場場主攜帶病死雞來河北科技師范學院動物醫院就診，經病理剖檢觀察后采集肝臟，脾臟，氣管等組織，備檢。

1.2 主要試劑與儀器

DNA，RNA提取試劑盒，RNA反轉錄試劑盒均購于TIANGEN生物公司；腸桿菌科和其他非苛養革蘭氏陰性桿菌鑒定試劑盒(比色法)購于bioMerieux,sa公司；DL2000 Marker，2×Taq Marker Mix 購于北京康為世紀生物科技有限公司；TSB培養基，血瓊脂平板，TSA平板購于北京奧星生物技術公司；胎牛血清購于Gibco公司；藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司。培養箱(IGS100)由美國熱電公司生產；超凈工作臺(SW-CJ-ZFD)由南京貝登電子商務公司生產；核酸凝膠電泳儀槽(DYCP-31DN)與PCR儀(C1 000 TOUCH)由北京六一生物科技有限公司生產。

1.3 試驗動物

選擇36日齡健康的肉雜雞20只作為試驗動物購買于秦皇島市昌黎縣某養雞場。

1.4 細菌鑒定與藥敏檢測

1.4.1細菌分離與培養 將病死雞的肝臟組織劃線接種于血瓊脂平板，于37 ℃培養12～18 h，挑取優勢菌落進行涂片鏡檢，觀察其形態結構。

1.4.2細菌生化鑒定 按試劑盒說明書對分離的菌株進行操作，用自動生化鑒定儀進行生化鑒定。

1.4.3細菌PCR鑒定 按照試劑盒說明書進行細菌DNA的提取，用16S rRNA的通用引物進行PCR擴增。反應條件為：94 ℃，5 min；94 ℃，45 s；56 ℃，30 s；72 ℃，1 min；72 ℃，5 min，引物序列：16S rRNA-F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，16S rRNA-R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGAC-3’。反應體系：2×Taq PCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL ，無RNA酶水6 μL。將PCR產物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定，觀察結果并將陽性產物進行測序，測序結果進行同源性分析和遺傳進化樹分析。

1.4.4致病性試驗 將20只36日齡肉雜雞隨機分為2組，每組10只，試驗組每只雞腹腔注射分離培養的菌液0.25 mL (CFU 108/mL)，對照組每只雞注射相同劑量的生理鹽水，觀察發病和死亡情況，對死亡的雞進行剖檢，無菌取其肝臟、肺等組織進行細菌分離鑒定和鏡檢。

1.4.5藥敏試驗 按照美國臨床檢驗標準委員會(NCCLS) 推薦的標準K-B紙片法對分離的菌株進行藥敏試驗，將TSB培養基(含50 mL/L的胎牛血清)培養的菌液，用滅菌的棉簽涂布在平板上，用無菌鑷子取藥敏紙片貼于培養基表面，37 ℃培養18～24 h，觀察結果并記錄。

1.5 病毒檢測

1.5.1雞新城疫病毒(NDV)和雞傳染性支氣管炎病毒(IBV)PCR檢測 無菌采集病死雞的氣管、脾臟，勻漿破碎后12 000 r/min，離心5 min，取200 μL的上清液，按照RNA提取試劑盒提取RNA，用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR的擴增，NDV反應條件為95 ℃，3 min；94 ℃，30 s；55 ℃，30 s；72 ℃，45 s；72℃，7 min。IBV反應條件為94 ℃，10 min；94 ℃，40 s；57 ℃，40 s；72 ℃，1 min；72 ℃，10 min。NDV與IBV的反應體系為2×Taq PCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL ，無RNA酶水6 μL。引物序列NDV-F；5’-AAGGAGCCTTGATCTATCTGTCGG-3’，NDV-R：5’-TGTGCCCCTTCTCCAGCTTAGTA-3’。引物序列IBV-F：5’-GAGGATCCATGGCGAGCGGTAAAGTATCTGGAA-3’,IBV-R:5’-GCCTCGAGTCAAAGTTCATTTTCACCAAGTGCT-3’。取PCR產物各5 μL于10 g/L的瓊脂糖凝膠中進行鑒定，觀察結果。

1.5.2雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)PCR檢測 無菌采集病死雞的喉頭氣管，勻漿破碎后離心取上清液200 μL，按照DNA提取試劑盒說明書進行樣品DNA的提取，以提取的DNA為模板，進行PCR擴增，反應條件為95 ℃，5 min；94 ℃，30 s；60 ℃，20 s；72 ℃，20 s；72 ℃，10 min。反應體系為2×Taq PCR Master mix 10 μL，上下游引物各1 μL，模板2 μL，無RNA酶水6 μL,引物序列ILTV-F:5’-GAAGATCTAATTATAGCCCAGGCGTGCAACCG-3’，ILTV-R：5’-CCCTCGAGTTAAGGATCCACGTAACTACCAAGTTCCACCCCGGAG-3’。取適量的PCR產物于10 g/L的瓊脂糖凝膠中進行鑒定，觀察結果。

2 試驗結果

2.1 臨床剖檢結果

剖檢結果顯示，患有雞呼吸道傳染病的雞脾臟腫大(圖1 A)，肝臟呈土黃色(圖1 B)，并有針尖大的出血點，腺胃乳頭水腫，乳頭上有出血點(圖1 C)，喉頭、氣管出血，伴有粘液和血凝塊(圖1 D)，卵泡變形，破裂，有黃色液體流入腹腔(圖1 E)。

2.2 細菌鑒定與藥敏檢測

2.2.1細菌分離培養與鏡檢結果 采集病雞肝臟組織在血液瓊脂平板上進行劃線培養，結果顯示，長出灰白色、圓形、濕潤、大小均勻不溶血的露珠樣菌落(圖2 A)；涂片經瑞氏染色可見陰性短桿狀，兩極濃染的藍色球桿狀菌，有莢膜(圖2 B)。

2.2.2細菌生化鑒定結果 分離的菌株能發酵葡萄糖、果糖、甘露醇，不發酵麥芽糖、鼠李糖，L天冬氨酸芳胺酶、精氨酸雙水解酶、尿素酶呈陰性；鳥氨酸脫羧酶、氧化酶為陽性，吲哚試驗為陽性。經自動生化儀鑒定分析，結果為多殺性巴氏桿菌，命名為FN-Q菌株。

2.2.3FN-Q菌株PCR擴增結果 PCR擴增實驗結果表明分離的2株FN-Q菌株在大約1 500 bp處出現目的條帶，與預期結果相符(圖3)。

2.2.4FN-Q菌株的同源性及進化樹分析 同源性分析實驗結果表明 FN-Q株的16S rRNA基因序列與Genbank中多殺性巴氏桿菌同源性達到99.5%以上(圖4)；系統進化樹分析實驗結果表明，FN-Q株與MN022586.1參考株處于同一分支，親緣性最近，FN-Q株、MN022586.1和MH150894.1參考株形成一個獨立的分支；FN-Q株與MG597096.1處于不同的分支，親緣性關系最遠，可能FN-Q株發生了變異(圖5)。

圖1 病雞的病理剖檢結果

圖3 分離菌株16S rRNA基因PCR 擴增結果M: DL2000 Marker；1，2：檢測樣品；3：陰性對照

圖4 FN-Q菌株同源性分析

圖5 FN-Q菌株系統進化分析

2.2.5FN-Q菌株的致病性檢測結果 對照組雞的采食、飲水、排泄均正常。試驗組雞只于攻菌后12 h開始發病，20只雞于24～36 h全部死亡。無菌采集死亡雞的肺臟、肝臟等組織進行細菌分離鑒定，鑒定結果與2.2.1分離的菌株一致，說明該菌株有很強的致病性。

2.2.6FN-Q菌株的藥敏試驗結果 FN-Q菌株對卡那霉素、恩諾沙星、頭孢曲松、丁胺卡那4種藥物有較強的敏感性，對頭孢拉定、氟苯尼考、環丙沙星3種藥物中敏，對磺胺間甲氧嘧啶、四環素、鏈霉素、新霉素、慶大霉素等7種藥物耐藥(表1)。

表1 FN-Q菌株的藥敏試驗結果

2.3 病毒PCR檢測結果

圖6 雞NDV PCR 檢測結果M: DL2000 Marker；1：陽性對照；2，3：檢測樣品；4: 陰性對照

2.3.1雞NDV PCR檢測 2份樣品PCR擴增后，在280 bp處沒有出現與陽性對照片段大小一樣的目的基因(圖6)，說明組織樣品中不存在NDV感染。

2.3.2雞IBV PCR檢測 2份樣品PCR擴增后均出現1 230 bp大小的目的基因片段，與陽性對照片段大小一致(圖7)，說明2份組織樣品中均存在IBV感染。

2.3.3雞ILTV PCR檢測 2份樣品PCR擴增后均出現334 bp大小的目的基因片段，與陽性對照片段大小一致(圖8)，說明2份組織樣品中均存在ILTV感染。

圖7 雞IBV PCR 檢測結果 圖8 雞ILTV PCR 檢測結果 M: DL2000 Marker；1：陽性對照； M: DL2000 Marker；1：陽性對照； 2，3：檢測樣品；4: 陰性對照 2，3：檢測樣品；4: 陰性對照

3 討 論

呼吸道病是養雞場最常見的一類疾病[4]，引起雞呼吸道病的原因有兩類，即傳染性和非傳染性，傳染性病原包括細菌、病毒、支原體等，非傳染性包括環境與管理等因素。冬季是呼吸道疾病的高發季節，進入冬季氣溫低下，氣候干燥，致病性微生物能較長時間存活，以及雞舍通風與保溫之間矛盾突出，有害氣體增加，如果不注重改善飼養環境，飼養密度過大，消毒不規范，免疫程序不合理，極易引起呼吸道疾病的發生[5]。本次試驗通過對病死雞剖檢病理觀察和病原檢測，發現導致該場雞死亡的原因為ILTV，IBV和多殺性巴氏桿菌混合感染。近幾年，雞呼吸道病原體多重交叉感染的現象逐年增多，所造成的經濟損失在大部分雞群中占全部疾病的50%以上。其中，雞傳染性喉氣管炎是由ILTV引起的一種急性、接觸性上部呼吸道傳染病，其特征是呼吸困難、咳嗽和咳出含有血樣的滲出物，典型病變在氣管和喉部組織[6～8]，目前因用于預防傳染性喉氣管炎感染的減毒疫苗的毒力偏強，免疫后可能形成潛伏感染，導致該病防治困難。

雞傳染性支氣管炎是由雞IBV引起的一種急性、高度傳染性的呼吸道疾病[9]，IBV的血清型眾多，根據血清型的不同，雞感染后出現的癥狀也各不相同，除侵害呼吸系統外，還導致泌尿系統和生殖系統的損傷。雞群在雛雞階段感染IBV后，到了產蛋期易出現“假母雞”，雞群產蛋率較低[10, 11]，維持在70%～80%左右[12]。產蛋期感染IBV后，產蛋率下降約10個百分點，蛋殼質量變差，嚴重影響雞群的生產性能。免疫接種是防控傳染性支氣管炎的主要手段，但在生產實踐中即使免疫后也時常會有發病現象，主要是因為不同血清型毒株的交叉保護作用較差，當疫苗毒株與當前流行毒株不一致時，不能產生針對流行毒株的特異性抗體，從而導致雞群發病。

禽巴氏桿菌病，又稱禽霍亂，是由多殺性巴氏桿菌引起的一種急性敗血性傳染病，最急性型常見不到明顯變化[13]，發病率和致死率很高。多殺性巴氏桿菌是一種條件性病原菌，當飼養管理不當，天氣突然變化，機體抵抗力下降或感染其他疾病時，均可誘發該病。目前，接種菌苗和使用抗生素仍是臨床上防治禽巴氏桿菌病的首選。但巴氏桿菌疫苗存在有效期短、毒力反強，成本高等問題；抗生素的頻繁使用導致耐藥性和藥殘問題也亟待解決。姜海清[14]研究表明，分離的禽霍亂菌株對氨芐西林和土霉素耐藥，常超越等[15]研究發現，禽巴氏桿菌菌株QHP-1株對阿莫西林、氨芐西林、四環素等5種抗生素耐藥；本次試驗從病死雞肝、脾等組織分離的FN-Q菌株對四環素、鏈霉素、新霉素、氨芐西林、慶大霉素等7種藥物耐藥，其耐藥種類呈上升趨勢，且該菌株有較強的致病性，這可能與用藥習慣以及盲目長期使用某種抗菌藥物有關。綜上所述，對于雞呼吸道疾病的防控，首先要制定科學的飼養管理方案，保持雞舍舒適的溫度、濕度和清潔的環境，確保適當的通風。制定日常巡查制度并做好記錄，做到早發現、早處理。在免疫方面制定合理的免疫程序，選擇與流行株一致的疫苗株，并定期監測免疫抗體水平，投藥前最好進行敏感藥物的檢測，做到科學精準防治。