電子鼻同步檢測花生霉菌及霉菌毒素

王 蓓，沈 飛,*，何學明，蔣雪松，袁 建，方 勇，胡秋輝，邱偉芬，MAMO Firew Tafesse

（1.南京財經大學食品科學與工程學院，江蘇省現代糧食流通與安全協同創新中心，江蘇 南京 210023；2.南京林業大學機械電子工程學院，江蘇 南京 210037；3.巴赫達爾大學生物技術研究所，埃塞俄比亞 亞的斯亞貝巴 5954）

花生是世界各地重要的農產品，中國是世界上最大的花生生產國，在滿足人們對油脂和蛋白質的需求方面起著至關重要的作用。然而，作為蛋白質、熱量、維生素和礦物質的良好來源，由于貯藏條件不佳，運輸條件不當，花生容易受到腐敗菌或產毒真菌的污染，其中最常見的是曲霉屬。黃曲霉毒素B（aflatoxin B，AFB）的污染是影響食品安全和質量的重要問題，對花生種植區造成了嚴重的經濟損失。此外，它也是導致肝癌的一個重要原因，被國際癌癥研究機構列為I類致癌物。我國GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》規定花生中AFB含量不超過20 μg/kg。

食品中黃曲霉毒素的常規檢測方法有微生物鑒定法、色譜法、酶聯免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、分子鑒定技術或聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）等。然而這些技術均較為繁瑣、檢測時間長、成本高，難以滿足現場大規模篩查的需求。因此，開發快速、無損的毒素檢測方法具有重要意義。花生腐敗霉變是一個復雜的過程，微生物在消耗大量營養物質同時氣味也發生了變化。而電子鼻可以有效檢測源自于微生物代謝的有害食物異味，在真菌毒素污染狀況預測方面具有突出優勢。迄今為止，電子鼻技術在水果、蔬菜、糧食、禽類等農產品品質檢測領域得到廣泛應用。有學者已經對糙米、小麥、稻谷、玉米等的霉變情況進行了檢測研究，并在糙米、玉米、大麥及小麥霉菌毒素快速分析方面展開了一定應用。在花生方面，葉藺霜利用電子鼻技術研究花生品質，區分相同貯藏時間的破殼花生與完好花生及新鮮花生與陳舊花生。劉鵬利用電子鼻有效區分受霉菌污染不同程度的花生樣品。林茂等利用電子鼻對烘烤樣品進行分析，能夠較好地區分生品、烤箱烘烤和微波烘烤樣品。

由上可知，前人對糧食霉變程度與真菌毒素分別進行檢測研究已有相關報道，但利用電子鼻技術同時檢測霉菌霉變程度及毒素含量的報道較少。因此，本研究擬以接種不同的產毒和非產毒菌株的花生樣品為研究對象，檢測其在不同貯藏時期（0～6 d）的電子鼻信號，建立花生受不同霉菌感染下的霉變程度及毒素含量的同步快速判別模型，以期為花生貯藏時期的安全提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

花生樣品取自南京當地超市。采用Ravindran等的方法對樣品進行徹底滅菌，經Co、劑量為12 kGy的輻照后，放置于無菌塑料袋中，在接種前保存于4 ℃。

從北納創聯生物技術研究所購買5 株花生中常見的真菌菌株（黑曲霉（）186380、黃曲霉（）142801、黃曲霉185860、黃曲霉185691、寄生曲霉（）335939）。所有菌株在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基于26 ℃和相對濕度80%條件下培養7 d，產生大量孢子。培養結束后，加入無菌蒸餾水，用無菌接種環從培養基表面分離得到孢子。真菌孢子濃度按GB/T 4789.2—2016《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》中平板計數法測定，加入無菌水調節最終濃度約為1×10CFU/mL。

1.2 儀器與設備

Fox-3000型電子鼻 法國Alpha MOS公司；AFBELISA試劑盒 北京華安麥科生物技術有限公司；SpectraMax M2E多功能酶標儀 美谷分子儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

將滅菌后樣品隨機分為6組（每組35 份，每份50 g花生），其中5組為實驗組且每個實驗組接種一株，另外1組為空白組。在無菌條件下，將5 株菌株的1 mL真菌懸浮液分別接種35 份樣品，共175 份樣品中。另外空白組（35 份樣品）只添加1 mL無菌水。所有樣品均置于210個無菌塑料盒中，在培養箱（26 ℃和相對濕度80% ）中培養6 d，以促進真菌的生長。接種后每天采集30 份樣品（5 份樣品×5個菌株+5個空白樣品）進行電子鼻測量分析，直至第6天。用標準平板計數法（GB/T 4789.2—2016）測定樣品的菌落總數，結果用重復3 次實驗的平均值（lg（CFU/g））表示。采用ELISA法測定樣品中AFB的含量（GB/T 5009.22—2016《食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》）。

1.3.2 電子鼻信號測量

電子鼻數據采集實驗使用FOX 3000電子鼻設備，它包含對揮發性化合物不同靈敏度和選擇性的12個氣體傳感器。該系統由3 部分組成：采樣裝置、傳感器陣列組成的探測器單元和數據記錄和分析的模式識別軟件。電子鼻的工作原理是基于人鼻的工作原理，通過模擬鼻內嗅細胞的傳感器陣列分析樣品的揮發性成分，然后這些信號被發送到模擬大腦功能的數據識別系統。傳感器陣列會產生一種特殊的氣味輪廓，稱為指紋圖譜，以響應揮發性分子與樣品的相互作用，通過將獲得的氣味輪廓與簡單的氣味標準進行比較識別混合物成分。指紋圖譜的變化可能是由于新化合物的形成或原始揮發性化合物數量的變化。當氣體接觸傳感器時會發生氧化還原反應，從而可以改變傳感器導電材料的導電性。采用適當的采樣系統可以提高分析質量。頂空氣體采樣系統通過消除影響傳感器響應的任何不利因素，可提供穩定和可重復的采樣，含有揮發性化合物的樣品的頂部空間通過氣流輸送到傳感器室。讀取響應值后，用惰性氣體電流吹掃兩個腔室，以去除任何可能的殘余氣味，并避免交叉污染。具體而言，將5 g樣品置于20 mL玻璃瓶中進行電子鼻分析，以提供固、氣相處于平衡狀態的環境。對每個樣品進行2 次重復，取平均值用于進一步分析。

1.4 多元統計分析

在本研究中，使用Matlab2015a和（美國Mathworks公司）和Unscrambler X 10.4軟件進行數據預處理和模型開發。首先，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）檢測分組模式。然后通過線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）和偏最小二乘判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLSDA）分別對產毒菌株和非產毒菌株、根據菌落總數、AFB含量超標與否進行定性分析。這些方法在文獻中被廣泛使用，并對其進行了大量描述。通過外部驗證結果評估LDA和PLS-DA模型。在外部驗證中，采用Kennard-Stone算法，將6組樣品的數據分別按2∶1的比例隨機分成建模集和預測集。LDA和PLS-DA分類模型的性能通過正確分類樣本的百分比和假陽性/陰性錯誤評估。

2 結果與分析

2.1 花生樣品菌落總數與AFB1含量分析

2.1.1 菌落總數分析

由圖1a可知，空白組平均菌落總數明顯低于實驗組，不同菌株的生長速率也不同，黃曲霉142801菌落總數在貯藏2 d后明顯高于其他菌株。貯藏初期，霉菌生長緩慢，甚至有些菌落總數減少，可能是由于花生表面接種菌株，其生長需要適應新的環境。除第1天外，空白和污染樣品的菌落總數均呈上升趨勢，感染程度繼續加深，這說明隨著時間的推移，霉菌在樣品中生長，產生大量的代謝物，從而使花生樣品揮發性成分更加復雜。因此，它為基于氣味信息的污染樣品的快速識別提供了可能。參照前人的研究，花生樣品按菌落總數可分為合格（＜2.7（lg（CFU/g））和霉變（≥2.7（lg（CFU/g））兩個階段。空白樣品在前6 d雖合格，但從第3天開始，由于環境影響，菌落總數也在穩步上升。除黑曲霉186380外其他接種的樣品在第3天均達到發霉狀態，而接種黑曲霉186380樣品第5天達到發霉狀態。

圖1 花生樣品貯藏0～6 d的平均菌落總數（a）和平均AFB1含量（b）Fig. 1 Average number of colonies (a) and average AFB1 content (b) in peanut samples stored for 0–6 days

2.1.2 AFB含量分析

由圖1b可以看出，黑曲霉186380、黃曲霉185691和空白組無明顯變化，主要是由于這兩種菌株為非產毒菌株，雖然會有霉菌繁殖，卻并未產生AFB。而寄生曲霉335939、黃曲霉142801和黃曲霉185860為產毒菌株，霉菌繁殖的同時產生了有毒的真菌次級代謝物，從而呈上升趨勢。參照GB 2761—2017，樣品可根據AFB含量分為兩類：正常（＜20 μg/kg）和污染（≥20 μg/kg）。黑曲霉186380、黃曲霉185691和空白組在第7天前均正常且含量遠低于20 μg/kg。然而，其他樣品在第3天被污染，且在貯藏后期由于繁殖迅速，產生大量毒素，危害人畜健康。因此，在更嚴重的情況發生前的早期確定污染水平具有重要意義。

2.2 電子鼻信號分析

從圖2a可知，不同污染樣品之間具有相似的趨勢，但仍存在一些差異。其中LY2/G、T30/1、T70/2和PA/2的響應值有顯著差異，而LY2/LG、LY2/gCT和P40/1的響應值無明顯變化。參考其他文獻中描述各傳感器的檢測范圍，花生霉變后可能產生碳氫化合物、芳香族類化合物等物質，且不同的真菌會產生不同的次生代謝產物，因此與這些產物相關的傳感器就會發出不同信號。花生結果表明，6種不同樣品的揮發性成分存在差異，為電子鼻技術區分不同霉菌侵染花生提供了可行性。

圖2 花生樣品貯藏第4天（a）、黃曲霉185860污染樣品在不同貯藏階段（b）12個傳感器響應值的雷達圖Fig. 2 Radar chart of 12 sensors’ response values for all peanut samples on the fourth day of storage (a) and radar chart of A. flavus 185860 contaminated samples at different storage stages (b)

由圖2b可知，黃曲霉185860污染樣品與其他被污染樣品有類似響應雷達圖。隨著貯藏時間的延長，不同傳感器呈現出一定變化趨勢。T30/1、T70/2和PA/2的響應信號隨污染程度的增加而逐漸減弱，而LY2/G、LY2/AA和LY2/GH的響應信號逐漸增強。說明在霉菌代謝過程中消耗花生中的營養物質，并產生胺、氨類化合物等物質，導致代表不同物質的電子鼻傳感器發出不同的信號，因此為電子鼻技術區分不同霉變程度的花生提供了可行性。

2.3 PCA結果

采用3種不同分類方法對花生樣品進行了PCA。PC1和PC2均代表99%以上的方差貢獻率，占原始數據方差貢獻率的大部分，可以解釋大多數樣本感染水平的差異。

圖3a是根據5種菌株是否產生黃曲霉毒素將樣本分為兩組（產毒菌株和非產毒菌株），分別為105 份和70 份樣品。從圖3a可以觀察到一定的聚類趨勢。雖然有一小部分樣本重疊，但大多數樣本可以被區分，產毒菌株污染的樣品大多數位于非產毒菌株污染樣品的右上方。

圖3b、c分別以AFB含量20 μg/kg、菌落計數2.7（lg（CFU/g））為閾值，將樣品分為正常/超標及合格/霉變兩類。然而，樣品之間沒有明顯的分離，原因可能是不同菌株信息的復雜度高或不同菌株之間存在相互干擾。但從圖中也可以看出污染樣品一部分位于可接受樣品的上方。綜合觀察圖3b、c可以看出毒素超標的樣品均達到了霉變，而某些樣品雖然達到了霉變程度，但其黃曲霉毒素含量并未超標，這類樣品可用于動物的飼料。

盡管PCA結果并不理想，但這些差異仍為進一步的判別分析提供了基礎。

圖3 3種不同分類方法PCA結果Fig. 3 PCA results with three different classification methods

2.4 識別模型的開發和驗證

PCA可以得到樣本間的聚類趨勢，但不能得到具體的分類結果。因此，LDA和PLS-DA模型被用來提高樣品之間的分離度。LDA模型是基于PCA得到的前10個PCs，因為它們覆蓋了原始數據中包含的大多數變化（＞99%）。PLS-DA是一種基于偏最小二乘回歸的有監督分類方法。它可以檢測數據與分類變量之間的關系，并可用于未知樣本的分類預測。樣本將被分成幾組，其中2/3樣品用于建模集，其余1/3樣品用于預測集。

2.4.1 產毒菌株和非產毒菌株污染樣品分類結果

表1 產毒菌株和非產毒菌株污染樣品分類結果Table 1 Classification results of contaminated samples with toxigenic and non-toxic strains

將5種真菌污染的樣品分為產毒菌株和非產毒菌株污染樣品。黃曲霉142801、黃曲霉185860和寄生曲霉335939為產毒菌株污染樣品（105 份），黑曲霉186380和黃曲霉185691為非產毒毒菌株污染樣品（70 份）。樣品分類結果見表1。結果顯示，LDA和PLS-DA模型能較好地區分同一貯藏時間下產毒菌株和非產毒菌株污染樣品，除第0天LDA模型外，建模集和預測集均達到100%，其中第0天僅有1 份樣品被誤判。所有樣品LDA和PLS-DA模型的建模集正確率分別為95.73%和97.44%，預測集正確率均為96.55%，分別有7 份和5 份樣品被誤判，可能由于不同霉菌的繁殖速率不同，導致不同節點產生的揮發性成分變化復雜，存在相互干擾。

2.4.2 根據AFB含量分類結果

表2為根據AFB含量（正常和超標）對樣品進行分類。所有平均建模集正確率為99.28%，平均預測集正確率為87.25%。LDA模型中，黃曲霉185860組中有1 份樣品被誤判，寄生曲霉335939、黃曲霉142801組中分別有2 份樣品被誤判，僅有寄生曲霉335939組樣品假陰性誤判率為5.0%，其余均為正常樣品被誤判為超標樣品。PLS-DA模型結果與之相似。另外，全部樣本模型的建模集正確率分別為90.71%和91.43%，預測集正確率均為90.00%。在貯藏過程中，花生樣品中的脂肪、蛋白質等營養物質會被霉菌消耗，從而產生大量的毒素和揮發性物質，導致電子鼻的響應值與貯藏前有較大差異。但霉菌產生的揮發性成分復雜，可能會存在互相干擾。沈飛等利用電子鼻技術檢測糙米中的黃曲霉毒素，顯示電子鼻信號與糙米中AFB、AFB、AFG、AFG及總量之間均有較高相關性，其中對AFB的預測精度最高。因此電子鼻技術對霉菌毒素的快速檢測具有可行性。

表2 根據AFB1含量分類結果Table 2 Results of classification according to AFB1 content

2.4.3 根據菌落總數分類結果

表3為根據菌落總數（合格和霉變）對樣本建立的LDA和PLS-DA模型結果。對于感染同一菌株的樣本，模型的平均建模集正確率為95.65%，預測集正確率為86.44%。在兩個模型中，黃曲霉185691組、黃曲霉185860組分別有2、3 份樣品被誤判，寄生曲霉335939組中有2 份樣品被誤判，黃曲霉142801組中有1 份樣品被誤判，而黑曲霉186380組最多，有5 份樣品被誤判。但除黑曲霉186380組有2 份外，其他僅有1 份發霉樣品被誤分類為合格樣品。假陰性非常重要，因為霉變樣本的錯誤分類會增加真菌感染和真菌毒素暴露的風險。另外，在210個樣本中，建模集和預測集的正確分類率分別為85.00%、81.69%和80.28%。可能出現的原因是不同霉菌之間揮發性成分復雜，存在互相干擾。除此之外，位于閾值附近的樣品也容易發生誤判。劉鵬利用電子鼻技術檢測花生受不同霉菌的污染程度，其真菌生長的水平同樣隨貯藏時間而變化。因此LDA、PLS-DA能夠識別和分類有無真菌感染的樣本，以及不同貯藏時間的真菌感染程度的樣本。

表3 根據菌落總數分類結果Table 3 Results of classification according to number of colonies

基于不同方面分別對電子鼻數據進行建模分析，結果表明，可以根據菌株產毒能力、菌落總數、毒素含量分別進行定性分析，模型正確率在80%以上。在實際生活中，某些受污染的花生雖然霉變，但并未產生AFB，此類花生可用于動物的飼料，可大大減少資源的浪費。將菌株產毒能力結合菌落總數共同建立模型，樣品分為4 類：合格/非產毒菌株污染樣品、霉變/非產毒菌株污染樣品、合格/產毒菌株污染樣品、霉變/產毒菌株污染樣品。其中建模集總正確率為81.42%，預測集總正確率為74.29%。為區分霉變但含少量毒素的這類樣品提供了可能性。此外，有些樣品雖然受到產毒菌株的污染，但如果在早期得到檢測，較早地采取措施，也可以避免花生的浪費。將菌株產毒能力結合AFB含量共同建立模型，由于非產毒菌株污染樣品的毒素含量遠低于超標含量，故將樣品分為3 類：非產毒菌株污染樣品、正常/產毒菌株污染樣品、超標/產毒菌株污染樣品。其中建模集總正確率為84.29%，預測集總正確率為85.71%。因此可以早期區分出正常/產毒菌株污染樣品，這類樣品可通過降解毒素等方式用于其他用途。將菌落總數結合AFB含量共同建立模型，樣品分為3 類：正常/毒素未超標樣品、霉變/毒素未超標樣品及霉變/毒素超標樣品。建模集總正確率為82.14%，預測集總正確率為81.43%。以上結果表明，電子鼻技術為同時快速檢測花生樣品中霉菌和黃曲霉毒素污染提供了一種新的可能手段。然而在實際情況下，受霉菌菌屬多樣性、花生品種和貯藏環境等多方面的影響，模型精度和穩健性可能會有所降低。因此，進一步應通過不斷擴充樣本數量、采用自然霉變花生等方式，不斷驗證和改善分析模型性能，以滿足實際檢測需求。

3 結 論

探討了電子鼻技術在花生霉菌和黃曲霉毒素污染同步快速檢測中的應用。PCA結果顯示樣品在不同霉菌污染下有一定的聚類趨勢；采用LDA、PLS-DA法可以很好將單一霉菌侵染樣品的霉變程度及毒素含量進行分類，正確率均在80%以上。同樣也采用這些方法對全部樣品進行分類，對產毒菌株樣品和非產毒菌株樣品分類正確率超過95%，根據霉變程度及毒素含量分類正確率也在80%以上，均取得了較高的分析準確率。綜上可知，基于電子鼻傳感的氣味分析技術，在花生霉變狀態和毒素污染程度同步快速識別方面具有可行性，為花生等糧油霉變早期監測和風險評估提供了一種新的技術手段。