阿托伐他汀通過NFATc1信號通路促進大鼠骨質疏松性骨折愈合

王琮仁 孔長庚 郭祥 金旭紅 吳多慶 范忠誠

骨質疏松性骨折(osteoporotic fractures,OPF)是臨床常見的骨科疾病，也是骨質疏松癥終末階段，多見于絕經后婦女及70歲以上老年人，發病率、致殘率均較高[1]。阿托伐他汀可抑制膽固醇合成，降低血液中脂蛋白膽固醇水平，常用于治療高膽固醇血癥及冠心病[2]。有研究認為，阿托伐他汀可增加骨量并改善骨代謝指標，促進骨質疏松癥病人成骨[3]。本研究建立大鼠OPF模型，觀察阿托伐他汀對其治療作用，并探討可能機制。

對象與方法

一、對象

3月齡SPF級SD大鼠，雌性45只，體質量(330±30)g，上海南方模式生物科技股份有限公司。許可證號SCXK(滬)2017-0010。

二、方法

1.藥物與試劑、儀器：阿托伐他汀鈣片，國藥準字H20051409，輝瑞制藥有限公司；兔抗大鼠活化T細胞核因子1(nuclear factor of activated T cells 1，NFATc1)、破骨細胞關聯受體(osteoclast associated receptor，OSCAR)、骨鈣素(osteocalcin，OCN)、I型膠原(I collagen，COL-I)一抗，美國R&D公司。EXA3000雙能X線骨密度儀，北京海富達科技有限公司；DM750顯微鏡，德國Leica公司。

2.實驗方法：(1)建立大鼠OPF模型[4]：40只大鼠背側入路于脊椎旁1 cm縱向切口，暴露卵巢后切除，術后注射青霉素；另取5只做假手術，僅暴露卵巢不切除，其余操作同建模大鼠。術后1周檢測建模大鼠骨密度，經雙能X線骨密度儀分析脛骨干骺端骨密度，與假手術大鼠比較，明確模型制備成功。術后4周麻醉大鼠，左側股骨外側切取縱向切口，暴露股骨后線鋸鋸斷，克氏針沿髓腔固定斷肢，閉合傷口。(2)分組及給藥[5]：40只OPF模型大鼠隨機分為模型組，實驗A、B、C組，各10只。術后次日，實驗A、B、C組灌喂阿托伐他汀生理鹽水溶液5 ml(分別含阿托伐他汀10、20、40 mg/kg)，模型組灌喂等體積生理鹽水。每日1次，干預6周。(3)X光片觀察大鼠骨折愈合情況[6]：末次干預完成后次日，麻醉大鼠，經X光掃描左側骨折股骨(50 kV、2.5 ms)，觀察骨折愈合情況。由2名以上經過專業訓練的研究員進行獨立雙盲評分。(4)生物力學測試檢測骨痂生物力學性能[7]：X光片拍照結束后處死大鼠，取左側股骨固定于兩端，以骨痂處為加載點，前端、后端跨距分別設置為8、20 mm，行三點彎曲實驗，記錄最大載荷、剛度。(5)HE染色觀察骨痂組織病理學變化[8]：生物力學實驗結束后，以骨折處為中心上下取8 mm×8 mm骨痂組織，分成兩份，一份置于-80 ℃冷凍，一份投入4%多聚甲醛中固定24小時，切片，HE染色，光鏡下觀察骨痂組織病理變化。(6)免疫印跡法檢測骨痂組織NFATc1、OSCAR、OCN、COL-I蛋白表達量[9]：取冷凍保存骨痂組織，裂解、離心后定量蛋白，取少量樣本與上樣緩沖液混合，變性、離心取上清，電泳、轉膜，封閉2小時后與兔抗大鼠NFATc1、OSCAR、OCN、COL-I一抗(1∶500)混合，4 ℃冰箱過夜，洗膜后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育，2小時后洗膜、發光、顯影，成像儀分析蛋白條帶，以GAPDH為內參，分析蛋白表達水平。

三、統計學處理

結果

1.X光片評分比較:與模型組比較，實驗組X光片評分升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且表現為劑量依賴性。見表1。

表1 各組X光片評分比較

2.生物力學測試結果的比較:與模型組比較，實驗組最大載荷、剛度增加(P<0.05)，且表現為劑量依賴性。見表2。

表2 各組生物力學測試結果比較

3.骨痂組織學觀察:HE染色結果顯示，模型組骨小梁方向性不明顯且較細，成骨不活躍；相較于模型組，實驗A、B、C組骨小梁較粗，部分成熟，存在明顯礦化，骨性骨痂較多，部分可見軟骨性及纖維性骨痂形成，骨外膜下可見成骨細胞形成骨小梁，表現為劑量依賴性。

4.骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達量的比較:與模型組比較，實驗組骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達量降低,差異有統計學意義(P<0.05)，且表現為劑量依賴性。見表3，圖1。

表3 各組骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達量比較

圖1 4組大鼠骨痂組織NFATc1、OSCAR蛋白表達量

5.骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達量的比較:與模型組比較，實驗組骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達量升高,差異有統計學意義(P<0.05)，且表現為劑量依賴性。見表4，圖2。

表4 各組骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達量比較

圖2 4組大鼠骨痂組織OCN、COL-I蛋白表達量

討論

OPF是指不受外力或在輕微外力下導致的脆性骨折，多為粉碎性，可造成嚴重功能損傷[10]。骨質疏松的發病機制尚未完全闡明，多認為與內分泌失調、必需元素攝入不足、成骨-破骨細胞失衡及遺傳等因素相關，其中成骨-破骨細胞調節失衡被認為是重要機制之一[11]。骨折愈合是骨折處骨痂組織重建過程，成骨細胞與破骨細胞分別調節骨形成與骨吸收過程，二者平衡促成骨骼更新，但骨質疏松病人破骨細胞增多而成骨細胞分化較少，骨折處骨形成受阻，愈合困難。

本研究結果顯示，OPF大鼠模型經阿托伐他汀干預后X光片評分升高，最大載荷、剛度增加，且表現為劑量依賴性，提示阿托伐他汀可促進骨折愈合，提升骨骼生物力學性能。阿托伐他汀是膽固醇合成限速酶，可抑制骨吸收相關酶活性，抑制破骨細胞生成分化，提升骨形成蛋白表達并提高其活性，促進成骨細胞分化及骨骼礦化，從而促進骨形成。Zhou等[12]研究認為，阿托伐他汀可抑制破骨細胞形成、促進成骨細胞分化，從而增加去卵巢兔模型骨骼機械參數，如最大載荷、剛度及能量吸收力，改善骨骼微結構，提示阿托伐他汀具有抗骨質疏松活性。

OSCAR是破骨細胞形成與分化過程中關鍵蛋白因子，作為免疫球蛋白受體，可相關銜接蛋白結合，使磷脂酶Cγ活化從而激活鈣離子信號分子，促進NFATc1表達。NFATc1是破骨細胞形成關鍵轉錄蛋白，可調控抗酒石酸磷酸酶、降鈣素受體、蛋白酶K等破骨細胞分化相關蛋白表達，其同時可與OSCAR啟動區結合位點結合，促進OSCAR表達，形成正反饋效應，與相關因子共同作用，促進骨吸收。Kwak等[13]發現，抑制OSCAR、NFATc1蛋白表達可抑制體外小鼠破骨細胞分化，抑制其功能，治療骨吸收過度導致的炎癥性骨病。COL-I是組成細胞外基質的主要有機成分，同時在成骨分化過程中促進成骨相關基因OCN的表達，OCN是由成熟骨細胞分泌的非膠原蛋白，通常聚集在骨礦化峰期后，其與COL-I被認為是骨形成中的重要生物學標志物。本研究結果顯示，OPF大鼠模型經阿托伐他汀干預后NFATc1、OSCAR蛋白表達量降低，OCN、COL-I蛋白表達量升高，且表現為劑量依賴性，提示阿托伐他汀對OPF促進愈合的作用可能是通過抑制NFATc1信號通路實現。