長鏈非編碼RNA在結直腸癌中的診斷價值和作用機制

任俊 吳敬 金田力 付濤

研究表明,長鏈非編碼RNA(Long non-coding RNA，lncRNA)的異常表達和突變在CRC的發生和發展中具有重要作用。lncRNA通常被定義為超過200個核苷酸的非編碼RNA(ncRNA)，這類隱性非編碼RNA在癌癥中起主要的致癌或抑癌作用。我們對lncRNA在CRC中的診斷價值及作用進行綜述。

一、lncRNA在CRC中的診斷價值

越來越多的lncRNA被報道為CRC診斷的標志物，由于其組織特異性，lncRNA可能比目前的DNA、蛋白質編碼RNA或蛋白質生物標記物等標記物更敏感。如CCAT1在CRC中顯著過表達，在癌前組織中的表達也明顯上調，基于其在CRC中獨特的表達特點，CCAT1已被確定為篩查癌前病變的潛在生物標志物及治療靶點[1]。有研究證實，SNHG11作為一種新的早期生物標志物用于CRC的診斷及預后預測[2]。另有學者將HOTAIRM1的診斷價值與CEA、CA199和CA125進行了比較，與CA199和CA125相比，HOTAIRM1診斷的可靠性更高，將HOTAIRM1與CEA結合使用可顯著提高敏感性和特異性[3]。在對晚期CRC病人的HOTTIP，PVT1和UCA1的綜合研究中，HOTTIP/PVT1/UCA1篩查與總體生存期相關，可作為預測性篩查，在晚期CRC病人篩查中具有出色的診斷性能[4]。此外，在血清、血漿和外周血單個核細胞等外周血中也可以檢測到lncRNA。因此，循環中的lncRNA可能成為腫瘤診斷的非侵入性分子標志物[5]。因此，lncRNA可被認為是CRC病人中有希望的診斷生物標志物，聯合檢測的診斷率和敏感度更高。

二、lncRNAs在CRC中的作用

1.lncRNA與CRC細胞凋亡與逃逸：有多項研究描述了lncRNA在細胞周期阻滯和凋亡中的調控作用。研究表明，DQ786243在CRC組織和癌旁正常組織中存在差異表達。體外實驗證明，DQ786243基因的敲除可抑制細胞增殖、侵襲和遷移。此外，DQ786243被認為與細胞凋亡和細胞周期進程有關[6]。另一項研究發現，CCAT2在CRC組織中明顯高表達，且與CRC病人預后不良相關，CCAT2能促進CRC細胞的生長增殖，抑制細胞凋亡[7]。研究顯示，LINC00346在CRC組織和細胞中顯著上調，過表達LINC00346可上調JAK1/JAK1和p-STAT3/STAT3的表達水平，顯著提高HT29和LoVo細胞的OD450值和菌落數量，降低凋亡率，上調Bcl-2，下調Caspase-3和Bax。敲除LINC00346對HT29和LoVo細胞的增殖和凋亡作用相反，沉默 LINC00346可通過抑制JAK1/STAT3信號通路抑制CRC細胞增殖，促進細胞凋亡[8]。Shi等[9]研究表明，BANCR在CRC中低表達，在SW480和HCT116細胞中，BANCR通過促進G1期阻滯和引起p21介導的凋亡影響細胞增殖。另一項研究證實，人CRC組織和CRC細胞系中的Loc554202低于正常對照組，Loc554202可能為一個有潛力的抑癌基因。通過轉染pCDNA-Loc554202后，S期細胞明顯減少，凋亡細胞比例明顯增加。特異性半胱天冬酶裂解級聯的激活是Loc554202誘導CRC細胞凋亡的原因之一[10]。

2.lncRNAs與腫瘤血管生成：惡性腫瘤中的血管生成是腫瘤生長所必需的，也是轉移途徑中的一個重要因素。研究表明，lncRNA在血管生成中起著關鍵作用[11]。研究表明，lncRNA母系表達基因3(MEG3)在包括CRC在內的多種腫瘤中表達水平較低，MEG3過表達在體內外均能抑制CRC細胞的增殖[12]。此外，MEG3的過表達不僅抑制血管內皮細胞的增殖，而且對血管內皮細胞的增殖和血管生成也有負面影響。 MALAT1在體外和體內被證明具有促進血管生成的作用[13]。有研究表明，轉染MALAT1 siRNA或Gapmers的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)出芽及細胞遷移率明顯增加。此外，在MALAT1-/-小鼠模型中，觀察到MALAT1通過調節血管密度、血管擴張和血流恢復來激活血管生成[14]。通過使用下一代核糖核酸測序和微陣列分析NORAD在缺氧條件下通過miR-590-3p調控人臍靜脈內皮細胞的血管生成。NORAD/miR-590-3p軸可能是HUVECs血管生成機制中的一種新的調控途徑，這為治療缺血/缺氧誘導的血管生成疾病包括腫瘤疾病提供了一個潛在的新視角[15]。因此，基于lncRNA的治療策略在調節組織血管化方面具有很大的應用前景，并可用于CRC的防治。

3.lncRNA在細胞周期中的作用：大量研究已經證實了lncRNA在CRC細胞周期和細胞凋亡中的作用。最近，報道了一種新型的lncRNA IQCJSCHIP1反義RNA 1(IQCJ-SCHIP1-AS1)功能。相對于對照，CRC組織顯示IQCJ-SCHIP1-AS1表達下降兩倍以上。IQCJ-SCHIP1-AS1的抑制與不良預后和通過控制細胞周期和細胞凋亡率增加細胞增殖相關[16]。lncRNA p53是癌癥中一個有據可查的抑癌基因，也被稱為“基因組守護者”，它調節DNA修復，細胞周期停滯和細胞凋亡。它通過促凋亡蛋白(例如PUMA，FAS和ndBAX)驅動凋亡。而且，p53通過誘導p21阻斷CDKs(細胞周期蛋白依賴性激酶)而啟動細胞周期停滯。研究表明，lncRNA小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)通過影響CRC細胞中p53及其靶標的蛋白水平，減少了G0/ G1期的細胞凋亡和調控細胞周期停滯[17]。此外，研究發現lncRNA MLK7反義RNA 1(MLK7 AS1)是一種新的預后因子，與CRC的腫瘤發生有關。據推測，MLK7 AS1的過表達通過下調CRC細胞中p21的表達啟動細胞周期停滯來促進腫瘤生長和細胞增殖[18]。最近又發現LncRNA STEAP3-AS1在結腸癌組織和細胞系中顯著增加,STEPA3-AS1高表達與結腸癌病人總體生存率低有關，其通過STEAP3影響CDKN1C表達調控結腸癌細胞周期進程。在體外實驗中，STEAP3-AS1基因敲除可抑制結腸癌細胞的增殖和遷移，并使結腸癌細胞阻滯在G0-G1期，其機制在于STEAP3-AS1的下調可通過上調STEAP3上調細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子1C(CDKN1C)的表達[19]。研究顯示，NR2F2-AS1在CRC中表達上調，NR2F2-AS1表達水平高的CRC病人總體生存率較低。Cyclin D1在CRC中也有上調，且Cyclin D1與NR2F2-AS1呈正相關。NR2F2-AS1沉默介導Cyclin D1下調，誘導CRC細胞G0/G1期阻滯[20]。研究表明，ZFAS1是CRC中的癌基因。ZFAS1可能通過破壞p53穩定性與CDK1/cyclin B1復合物的相互作用影響細胞周期進程和抑制凋亡，增強CRC的癌變作用[21]。總之，lncRNAs可以通過調節p53、p21，抗凋亡和促凋亡蛋白等關鍵蛋白來控制細胞周期和凋亡。

4.lncRNAs和EMT：EMT是原發腫瘤細胞獲得遷移和轉移能力的潛在驅動力之一。大量的lncRNA被報道參與EMT進程的調節[22]。如lncRNA KIAA0125被顯著抑制并且與CRC組織和細胞系中的細胞生長和侵襲有關。已發現異位過表達的KIAA0125通過調節CRC中的Wnt/β-catenin信號傳導來阻止EMT[23]。鋅指增強子結合蛋白1/2(ZEB1/2)的過度表達通過EMT進程的激活促進波形蛋白的轉錄與E-鈣粘蛋白轉錄的抑制。據報道，高BANCR表達組比低BANCR表達組更嚴重的淋巴結轉移相關。為進一步了解其內在機制，Fu等在HCT116細胞和Caco-2細胞中檢測E-鈣粘蛋白和波形蛋白的表達，結果顯示BANCR通過抑制波形蛋白的表達和促進E-鈣粘蛋白的表達來誘導EMT表型[24]。Chen等[25]采用Western blot分析了EMT相關基因(E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Snail-1)的表達，研究發現SNHG16的敲除導致E-cadherin顯著上調，Vimentin，N-cadherin和Snail-1顯著下調。免疫熒光結果顯示，SNHG16基因的敲除促進了E-cadherin的表達水平，而減弱了N-cadherin的表達水平。SNHG16基因的敲除減弱了CRC細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。

Chen等[26]研究發現，ADAMTS9-AS1水平與TNM分期、淋巴結浸潤及較差的生存預后相關。缺失ADAMTS9-AS1可顯著抑制細胞增殖、G1/S過渡、遷移和侵襲和EMT進程，ADAMTS9-AS1可能是一個有潛在的治療靶點和預后因子。HOTAIR在結直腸癌組織和細胞系中均高表達，提示其在結直腸癌中具有調節作用。HOTAIR基因的敲除抑制了結直腸癌細胞的體外活力、遷移、侵襲和EMT，抑制了裸鼠結直腸癌的增殖和轉移。進一步研究發現HOTAIR通過招募轉錄因子SNAIL抑制HNF4α，而過表達HNF4α可抑制CRC細胞的活力、遷移、侵襲和EMT[27]。lncRNA是被證明對CRC病人EMT相關基因有調節作用，是EMT的主要調節因子和不良結局的預測因子，但其機制還沒有被充分研究。

5.lncRNA在CRC細胞DNA損傷反應中的作用：lncRNA可以通過調節不同的基因來調節DNA損傷反應，DNA損傷反應作為一個多功能的信號過程被激活，參與DNA損傷修復、細胞周期檢查點和細胞去向的因子，從而驅動腫瘤發生。例如作為一種轉錄因子，P53負責周期阻滯、DNA修復和細胞凋亡，從而限制癌癥的發展[28]。研究表明，DNA損傷以p53依賴的方式刺激lncRNA-MeG3的表達。因此，當Meg3沉默時，MDM2和p53之間的相互作用和p53的降解減少。最終，p53靶基因的表達被誘導。這些事件導致p53信號激活、DNA修復、細胞周期停滯和凋亡[29]。p53誘導的非編碼RNA(PINCR)已被證明通過調節p53靶向基因(包括在G1阻滯和凋亡中)而在DNA損傷暴露中過表達。研究表明PINCR直接由p53誘導，并且通過對Matrin3進行海綿化來響應CRC中的DNA損傷而發揮了其作用[30]。Matrin3是高度保守的核蛋白，有助于RNA代謝和DNA修復(通過使復合物與RAD51結合)。已經證明，Matrin3的細胞內消耗導致DNA損傷和放射療法敏感性的升高[31]。

Liu等[32]研究證實，lncRNA-RI與CRC細胞的DNA損傷修復和放射敏感性密切相關。lncRNA-RI通過與miR-4727-5p的競爭結合調節LIG4的表達，參與DNA損傷修復，影響細胞周期和輻射敏感性,他們認為lncRNA-RI是一個重要的CRC治療靶點，它的敲除可以抑制腫瘤細胞的DNA損傷修復能力。此外，lncRNA、BRAF激活的非編碼RNA(BANCR)在CRC中表達上調，與腫瘤的發生和化療耐藥有關。有研究認為，BANCR通過海綿吸附miR-203，通過上調CRC中CSE1L來增強DNA修復反應，從而發揮其作用[33]。以上數據證明了lncRNA在CRC腫瘤發生中的重要作用。

6.lncRNA在CRC表觀遺傳學中的作用:lncRNA不僅通過上述機制參與CRC腫瘤進程的調節，其在CRC表觀遺傳上也有重要作用。Zhi等[34]研究表明，腫瘤抑制物lncRNA腦源性神經營養因子反義(BDNFAS)被顯著下調，與CRC組織和細胞系中GSK-3β的表達呈負相關。這表明BDNFAS的誘導通過阻斷GSK-3β的表達來阻止細胞增殖和侵襲。抑制GSK-3β募集的EZH2和隨后的H3K27me3，使CRC中的GSK-3β啟動子沉默。GSK-3β是Wnt/β-catenin，PI3K/PTEN/AKT和Notch信號通路的下游組成部分，在DNA修復，堿基切除修復和雙鏈斷裂修復中具有主要功能。在另一個例子中，lncRNA HOXD簇反義RNA1(HOXD-AS1)被闡明在CRC中被下調，并與CRC病人的不良預后相關，其通過控制PRC2來下調HOXD3，從而在HOXD3啟動子上積累H3K27me3，從而激活MAPK / AKT信號通路[35]。

在另一項研究中，在CRC組織中lncRNA ST3Gal6反義1(ST3Gal6-AS1)被下調，ST3Gal6-AS1通過將組蛋白甲基轉移酶MLL1募集到調節α-2、3唾液酸化并阻斷PI3K/Akt信號傳導的ST3Gal6啟動子來激活唾液酸轉移酶ST3Gal6。因此，ST3Gal6-AS1使Foxo1核化并驅動CRC細胞中的發生[36]。Kunitoshi等發現從PVT1位點轉錄的PVT1 lncRNA的高表達與II和III期CRC病人的低生存率相關。PVT1基因異常甲基化與相應的PVT1 lncRNA表達降低及MYC基因表達呈負相關。對CRC轉錄本的生物信息學分析表明，PVT1位點還可能廣泛影響與CRC相關的兩條關鍵信號通路TGFβ/SMAD 和Wnt/βCatenin其他關鍵基因的表達和功能。PVT1是一種新的MYC致癌增強子，其活性受CRC異常甲基化介導的表觀遺傳調控[37]。lncRNA介導的表觀遺傳失調在很大程度上決定了基因的異常表達，并且表觀遺傳失調具有高度的物種特異性。分析管道可以有效地揭示表觀遺傳失調的癌癥和細胞特異性模塊，這些模塊可能為識別表觀遺傳失調的診斷、治療和預后靶點提供新的線索。

三、CRC中lncRNA的預后價值

有研究表明，lncRNA異常表達可能與CRC病人的不良預后和臨床病理特征惡化有關。如與健康對照組比較，在非轉移性CRC中血清外H19，HULC和HOTTIP被下調。此外，HOTTIP表達水平與不良的總生存率顯著相關。此外，多因素分析證實，HOTTIP是CRC病人獨立預后因素[38]。另有研究表明，lncRNA MIR4435-2HG的過表達與不良的臨床病理特征(如TNM分期和CEA水平)相關。此外，相對于鄰近的正常組織，高水平的MIR4435-2HG病人表現出無進展生存期和總體生存率下降[39]。綜上所述，除了診斷價值外，lncRNA在CRC病人中顯示出較高的預后預測價值，在臨床病理學評估中可用作預后生物標志物。

四、展望

最近，在CRC中廣泛發現了lncRNA在多種細胞和生物學過程中的作用以及腫瘤發生和轉移。大量研究表明，lncRNA的異常表達已通過不同的方式在CRC中被調節，如細胞凋亡與逃逸、血管生成、細胞周期、上皮-間充質轉化(EMT)、DNA損傷修復以及表觀遺傳學等，另外其有大量的潛在功能及作用機制需要進一步探索。