基于Wntβ-catenin通路探討巨噬細胞對全髖關節置換術后骨溶解的影響

韓杰 斯焱 張鵬 陳果 畢夢娜 李鐘 朱江偉 張上上 陳經勇

股骨頸骨折首要選擇是手術治療，其中全髖關節置換術(total hip arthroplasty，THA)在急性移位型股骨頸骨折的治療中具有良好效果。有研究發現，股骨頸骨折后期繼發股骨頭壞死行二期THA容易發生骨溶解等并發癥，臨床上對于該現象出現的機制尚不完全明確[1]。巨噬細胞可以依據其細胞的表型以及功能的差異分為兩種類型，其中M1型是經典活化型能夠分泌白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α等促炎性細胞因子，M2型則是替代性活化型，主要高表達抑炎細胞因子，形成并活化破骨細胞，導致假體周圍發生骨溶解[2]。Wnt家族蛋白是一類與胚胎骨骼形成、組織修復等有關的蛋白，Wnt/β-catenin通路的啟動可以促進巨噬細胞向M1極化而抑制其向M2極化，從而調節炎性反應參與骨喪失，但是在THA中其作用機制仍不清楚[3]。本文主要基于Wnt/β-catenin信號通路探討巨噬細胞在THA后骨溶解的影響。

對象與方法

一、對象

2018年12月～2020年12月接受THA術且未出現骨溶解的病人60例為對照組，男27例，女33例；年齡61～75歲，平均年齡(66.72±2.09)歲；均為股骨頸骨折，后期繼發股骨頭壞死行二期THA；假體均為金屬對聚乙烯全髖關節假體。同期出現THA后骨溶解的病人55例作為研究組，男26例，女29例，年齡60～75歲，平均年齡(67.12±1.95)歲；均為股骨頸骨折，后期繼發股骨頭壞死行二期THA；假體均為金屬對聚乙烯全髖關節假體。兩組病人基本資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經過倫理委員會批準。納入標準：(1)年齡60～75歲；(2)均為股骨頸骨折，后期繼發股骨頭壞死行二期THA；(3)簽署知情同意書。排除標準：合并凝血功能障礙；合并心血管、免疫系統、血液學疾病、惡性腫瘤；近期內使用激素、降鈣素等影響骨代謝的藥物。

二、方法

1.骨密度檢測：通過雙能X射線骨密度儀檢測骨密度，通過Gruen分區檢測置換髖關節周圍7個區域的骨密度。

2.IL-6、TNF-α及骨代謝因子β膠聯降解產物(β-CTX)的檢測：采用酶聯免疫吸附法。在手術后和出現骨質疏松后(對照組同期)收集外周靜脈血，將5 ml血液樣本通過酶聯免疫吸附測定，根據試劑盒標準曲線計算炎性細胞因子IL-6和TNF-α的濃度，以及骨代謝因子β膠聯降解產物(β-CTX)的濃度。

3.蛋白質印跡法：通過總蛋白提取試劑盒提取出現骨質疏松的骨組織中的總蛋白。分別通過蛋白質印跡法測定，分析目標蛋白條帶相對于β-actin的灰度值，分析CD68、CD206和β-catenin蛋白總表達量。

三、統計學方法

結果

1.兩組病人炎性細胞因子和骨代謝水平比較：研究組的IL-6為(79.16±14.35)pg/ml)，TNF-α為(101.86±15.34)ng/ml和β-CTX為(0.38±0.07)pg/L，對照組分別為(22.84±3.57)pg/ml、(49.62±7.11)ng/ml和(0.17±0.04)pg/L，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.兩組病人巨噬細胞水平比較見圖1。通過標志蛋白CD206和CD68評估M1和M2型巨噬細胞水平。結果顯示，研究組的CD206蛋白表達量和CD206/CD68比值高于對照組，而CD68蛋白表達量低于對照組。

圖1 蛋白質印跡法檢測兩組CD206和CD68蛋白表達量

3.兩組病人Wnt/β-catenin通路水平比較見圖2。研究組β-catenin蛋白表達量低于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 蛋白質印跡法檢測兩組β-catenin蛋白表達量

4.β-catenin蛋白表達量與巨噬細胞的相關性見表1。結果表明，β-catenin蛋白表達量與M1型巨噬細胞標志蛋白CD206的表達量負相關，與M2型巨噬細胞標志蛋白CD68的表達量正相關，差異有統計學意義(P<0.05)，β-catenin蛋白表達量與CD206/CD68比值負相關，差異有統計學意義(P<0.05)。

表1 β-catenin蛋白表達量與巨噬細胞的相關性

5.巨噬細胞與炎性細胞因子和骨代謝水平的相關性見表2。結果表明，CD206蛋白表達量與炎性細胞因子IL-6和TNF-α、骨吸收因子β-CTX正相關；CD68蛋白表達量與IL-6、TNF-α、β-CTX負相關；CD206/CD68比值與IL-6、TNF-α、β-CTX正相關，差異均有統計學意義(P<0.05)。

表2 巨噬細胞與炎性細胞因子和骨代謝水平的相關性

討論

有研究發現，假體周圍磨損顆粒會導致人工關節假體的周圍界膜組織中產生大量的巨噬細胞并發生一系列的生物化學反應，最終造成了THA術后骨溶解；此外，骨髓源性的巨噬細胞在THA術后骨溶解的發生、發展中發揮著重要的作用，其中界膜組織中數量眾多的巨噬細胞吞噬摩擦界面的顆粒，從而分泌大量炎性細胞因子包括IL-6、TNF-α等，形成正反饋循環，讓細胞宿主產生防御反應；而接下來在骨吸收期間作為破骨細胞前體，可以分化為成熟破骨細胞發揮骨吸收功能，最終造成THA術后骨溶解[4]。巨噬細胞作為磨損顆粒靶向作用期間最為重要的細胞，檢測骨溶解位置獲取的界膜組織均能夠發現大量的巨噬細胞，其內部具有大量磨損顆粒，說明吞噬功能已經被活化。張晨等[5]研究發現，結果發現巨噬細胞在吞噬大量的磨損顆粒后會分泌大量的IL-6、TNF-α等炎癥介質；其中，巨噬細胞主要M1型和M2型兩種類型，M1型巨噬細胞正向參與免疫應答，發揮免疫監視的功能；M2型巨噬細胞抑制免疫應答[6]。β-CTX是膠原被降解后釋放入血的小分子片段，β-CTX水平的升高提示破骨細胞活性增加，出現骨溶解[7]。本研究結果顯示，出現骨溶解的THA病人的β-CTX、IL-6和TNF-α水平高于對照組。此外，出現骨溶解的THA病人中，CD206升高而CD68降低，表示巨噬細胞向M1極化，而M1型巨噬細胞會通過分泌炎性因子導致骨溶解，從而導致溶骨性疾病中的骨吸收和抑制骨形成[8]。相關性分析結果顯示，IL-6和TNF-α、骨吸收因子β-CTX與CD206和CD206/CD68正相關，與CD68負相關。提示在THA骨溶解過程中，巨噬細胞向M1極化分泌IL-6、TNF-α引起炎性反應，從而啟動破骨細胞導致骨溶解。

β-catenin作為Wnt/β-catenin信號通路內的關鍵因子，可以結合細胞核內的淋巴增強因子/T細胞轉錄因子形成復合物，發揮調控Wnt/β-catenin靶基因轉錄的作用。有研究發現，當Wnt/β-catenin被抑制以后，細胞質中的β-catenin水平水迅速上升，然后進入細胞核內，結合淋巴增強因子/T細胞轉錄因子形成一種新型復合體，作用于DNA，從而誘導下游信號的靶基因進行轉錄，改變成骨細胞的細胞周期，讓其從G1期轉為S期，同時促進成骨細胞成熟；當β-catenin的功能缺失將會直接抑制了成骨細胞分化、成熟[9]。此外，相關研究已經顯示，Wnt通路在骨溶解中的關鍵作用，Wnt信號通路下調會抑制成骨細胞的增殖導致骨質疏松[10]。啟動Wnt /β-catenin通路后，巨噬細胞的M1型極化被抑制，TNF-α細胞因子的表達降低，從而促進軟骨細胞的分化[11]。本研究結果顯示，出現骨溶解的THA病人中β-catenin蛋白表達量顯著降低，且與M1型巨噬細胞標志蛋白CD206的表達量負相關，與M2型巨噬細胞標志蛋白CD68的表達量正相關。提示在出現骨溶解的THA病人中，β-catenin通路的抑制會促進巨噬細胞向M1型極化而抑制向M2型極化，從而引起炎性反應導致骨溶解。此外，β-catenin調控巨噬細胞極化，而巨噬細胞水平與骨溶解指標正相關，提示β-catenin蛋白可能成為預測和評估骨溶解的指標。