復合酶法提取褐藻可溶性膳食纖維的工藝優化及其抗氧化功能測定

劉雨萌 ， 冷 嵩， 薩仁高娃

(1. 珠海科技學院 藥學與食品科學學院， 廣東 珠海 519041；2. 珠海科技學院 計算機學院， 廣東 珠海 519041)

海藻是一種兼具食用和藥用價值的大型藻類， 也是我國海水養殖的重要品種之一. 研究表明， 褐藻糖膠與海藻膳食纖維具有降血脂、 降血糖、 抗凝血、 緩解便秘、 多種免疫調節功能以及生物活性[1]， 是一種營養價值極高的功能性食品. 目前我國海藻工業的加工提取技術較差， 導致海藻的利用率較低. 研究表明， 我國有超過9%的居民攝入膳食纖維量不足， 遠低于每日推薦的30%攝入量[2]. 因此， 海藻膳食纖維產品開發將會有巨大的經濟價值和社會價值， 市場前景廣闊.

褐藻是我國沿海地區常見的大型海藻之一， 目前主要采用乙醇沉淀法[3]和微波輔助提取法[4]進行褐藻可溶性膳食纖維素(SDF)的提取. 酶法具有反應條件溫和、 綠色、 環保、 高效等優點[5]. 當產品中有超過10%的SDF時， 其具有較強的生理功能和保健功能. SDF在多數天然產品中的含量均較低， 通常存在不溶性雜質. 可使用特定酶將膳食纖維的糖苷鍵斷裂， 使大分子變成小分子， 進而提高其溶解性， 同時會提高SDF含量， 并且得到的SDF具有更好的理化性質. 通過向原材料中加入某些特定的酶如水解淀粉的淀粉酶、 水解蛋白質的蛋白質酶進行酶法改性， 從而提高膳食纖維的純度； 或加入纖維素酶作用于纖維素糖苷鍵， 破壞其大分子長鏈， 以得到更多的小分子， 從而提高SDF的溶解性. 復合酶水解膳食纖維素可使SDF產率更高[6-10]， 目前用復合酶法提取褐藻可溶性膳食纖維尚未見文獻報道.

基于我國人群營養狀況現狀， 選取廣東地區易得且廉價原料褐藻進行研究， 采用復合酶提取褐藻SDF， 并考察其理化性質和抗氧化功能， 為褐藻功能性食品研究提供可靠的理論支持.

1 材料和方法

1.1 材料和儀器

褐藻產自廣東珠海附近海域海岸沿線， 由珠海科技學院藥學與食品科學學院申斯樂教授鑒定； 纖維素酶(50 U/mg， 其中U為25 ℃下， 1 min內能轉化1 μmol底物的酶量)、α-淀粉酶( 4 U/mg) 、 木瓜蛋白酶 (10 U/mg)購自上海源葉生物科技有限公司； 半纖維素酶(105U/g)購自河北潤步生物科技有限公司； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基和2,2′-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS·)自由基試劑購自大連美侖生物技術有限公司； 鹽酸、 無水乙醇、 氫氧化鈉購自國藥集團化學試劑有限公司， 分析純試劑.

恒溫水浴鍋(H-6型， 常州澳華儀器有限公司)； 分析天平(AR552CN型， 德國賽多利斯科學儀器公司)； 紫外分光光度計(SP-752型， 上海光譜儀器有限公司)； 冷凍干燥機(ALPHA 1-2 LD plus型， 德國 Christ公司).

1.2 方 法

1.2.1 褐藻 SDF 提取

1) 工藝流程. 褐藻烘干處理→超微粉碎→加入復合酶進行酶解→蛋白酶水解→加入30倍w=1%碳酸鈉溶液→65 ℃水浴2 h→φ=95%乙醇脫水→冷凍干燥→海藻SDF干粉.

2) 復合酶. 用m(纖維素酶)∶m(半纖維素酶)∶m(α-淀粉酶)=20∶5∶1進行褐藻SDF提取. 精準稱取5.00 g的褐藻粉樣品， 將樣品置于燒杯中并加入適量蒸餾水， 先調節溶液pH=6.5， 再加入復合酶， 水浴加熱過程中用玻璃棒不停攪拌.

3) 褐藻SDF提取率的計算公式為

提取率SDF=m/M×100%，

其中m為可溶性膳食纖維的干質量(g)，M為褐藻粉的干質量(g).

1.2.2 提取條件的單因素實驗

精準稱量5.00 g褐藻粉， 置于100 mL燒杯中， 以m(固， g)∶V(液， mL)=1∶20(固液比)、 60 min的酶解時間、 60 ℃的酶解溫度、w=1.5%的復合酶(根據干粉質量計算)為基本條件， 依次改變某一條件研究其對褐藻SDF提取率的影響. 確定復合酶的酶解時間依次為20，40，60，80，100 min; 固液比依次為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30 g/mL； 將酶解溫度依次調至35，45，55，65，75 ℃； 復合酶的添加量(質量分數)依次為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%.

1.2.3 提取條件的響應面實驗

用Design Expert 10.0軟件的Box-Behnken法， 將自變量設為A: 復合酶添加量;B： 復合酶酶解時間;C: (固液比)-1;D: 復合酶酶解溫度. 以褐藻 SDF 提取率為響應變量， 根據單因素提取的實驗結果， 確定自變量的水平編碼， 結果列于表1.

表1 Box-Behnken 方案設計的因素及水平編碼

1.2.4 褐藻 SDF 理化性質測定

1) 持水力的測定. 持水力是當沒有大氣壓力和重力的情況下， 樣品對水分結合的能力. 精確稱取褐藻膳食纖維1.00 g于燒杯中， 加入適量水搖勻， 室溫放置1 h. 膳食纖維吸水后用濾紙過濾， 稱取結合水后的褐藻SDF. 將SDF吸水前后的質量差除以1.00 g， 即得膳食纖維持水力(g/g).

2) 膨脹力的測定. 精確稱取褐藻膳食纖維1.00 g于量筒中， 先記錄SDF初始體積, 再加入適量蒸餾水搖勻， 室溫靜置24 h， 記錄SDF吸水后的體積, 吸水前后的體積差為膳食纖維膨脹力(mL/g).

1.2.5 褐藻SDF的抗氧化能力測定

采用DPPH·自由基清除能力和ABTS·自由基清除能力兩種方法測試褐藻SDF抗氧化作用[11].

1) DPPH·自由基清除能力測試. 將凍干褐藻 SDF配成質量濃度分別為0.4,0.8,1.2,1.6,2.0 mg/mL的溶液. 總反應體系為4 mL， 終質量濃度為配置樣品質量濃度的1/4. 按文獻[12]方法測定褐藻SDF對DPPH·自由基的清除能力.

2) ABTS·自由基清除能力測試. 按文獻[12]方法測定褐藻SDF的ABTS·自由基清除能力.

1.3 數據處理

每組數據取3次實驗的平均值. 用軟件 SPSS 18.0和graph 8.0分別進行單因素方差分析和繪制圖表， 數據用(平均值±標準差)表示.

2 結果與分析

2.1 褐藻 SDF 單因素實驗

2.1.1 復合酶酶解時間對提取率的影響

圖1為復合酶酶解時間對提取率的影響. 由圖1可見： 當酶解時間為20～60 min時， 褐藻SDF 提取率逐漸增加； 酶解60 min時的提取率最大； 繼續增加酶解時間， 褐藻SDF提取率降低. 因此最佳的酶解時間為60 min.

國內外學者都在商務合同的研究上取得了豐富的成果，但他們的研究重點有所不同。海外學者專注于研究商務合同的特征，而中國學者則更加關注商務合同的風格特征及其翻譯。整體而言，我國的商務英語翻譯研究起步較晚。商務合同兼具商務英語和法律英語的特點，因此使得商務合同翻譯的難度加大。令人欣慰的是，我國學者近年來對于這一領域的研究明顯增多和加強。在商務英語合同翻譯的文本特征、翻譯標準和翻譯方法等方面均有涉獵。

圖1 復合酶酶解時間對提取率的影響Fig.1 Effect of enzymatic hydrolysis time of complex enzyme on extraction rate

2.1.2 酶添加量對褐藻 SDF提取率的影響

圖2為酶添加量對褐藻 SDF提取率的影響. 由圖2可見： 當酶添加量為0.5%～2.0%時， 褐藻SDF提取率隨酶添加量的增加而上升， 此時酶和底物充分反應； 當酶添加量超過2.0%時， SDF提取率開始下降， 可能由于過量的酶會作用于可溶性膳食纖維， 導致提取率降低. 因此最佳的酶添加量為2.0%.

圖2 酶添加量對褐藻 SDF提取率的影響Fig.2 Effect of enzyme addition on extraction rate of brown algae SDF

2.1.3 固液比對褐藻SDF提取率的影響

圖3為固液比對褐藻SDF提取率的影響. 由圖3可見， 褐藻SDF提取率隨固液比的減小而升高， 之后趨于平穩. 綜合考慮成本和提取率兩方面因素， 設置1∶25為最佳固液比.

圖3 固液比對褐藻SDF提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of brown algae SDF

2.1.4 酶解溫度對褐藻 SDF 提取率的影響

圖4為酶解溫度對褐藻SDF提取率的影響. 由圖4可見： 當酶解溫度為35～55 ℃時， 褐藻SDF提取率隨溫度上升而增加; 溫度為 55 ℃時的提取率最大, 之后提取率逐漸下降. 溫度對酶活影響較大： 適宜溫度下酶能達到最高活性； 但當溫度過高時， 酶活下降， 甚至失活， 進而降低提取效率. 因此最佳的酶解溫度為55 ℃.

圖4 酶解溫度對褐藻SDF提取率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on extraction rate of brown algae SDF

2.2 褐藻 SDF 的響應面優化實驗

2.2.1 響應面回歸模型的建立和方差分析

表2 響應面實驗結果

使用 Design Expert 10.0 對實驗數據進行擬合， 得到二次多項式回歸方程為

Y(%)=37.71+2A+3.45B+0.042C-1.93D-0.17AB-0.22AC+0.37AD+

0.24BC-0.67BD+0.54CD-2.77A2-3.80B2-0.75C2-5.93D2.

表3 回歸模型與方差分析結果

2.2.2 響應面分析

三維響應面是回歸方程的圖形表現形式， 可預測和檢驗變量和響應值與各變量水平間的相互作用關系． 圖5為響應值對應各實驗因素(A,B,C,D)分別對褐藻SDF提取率的影響．利用Design-Expert軟件進行擬合的回歸方程計算， 預測酶解法對褐藻SDF提取的最佳工藝條件是： 73.88 min的酶解時間, 2.17%的加酶量, 1∶24.95的固液比, 53.22 ℃的酶解溫度. 在最佳條件下， 最大SDF提取率為39.02%. 考慮實際情況， 將工藝參數調整為: 1∶25的固液比, 2.2%的加酶量, 75 min的酶解時間, 55 ℃的酶解溫度. 該實驗條件下進行3組平行實驗， 得到褐藻 SDF提取率為38.15%±0.24%， 相對誤差為2.23%. 預測值與實驗值無顯著性差異(P>0.05)， 表明模型預測結果正確， 能準確反映提取中各影響因素對褐藻SDF 提取率的影響情況.

圖5 響應值對應各實驗因素對褐藻SDF提取率的影響Fig.5 Effect of response values corresponding to various experimental factors on extraction rate of brown algae SDF

2.3 褐藻SDF的理化性質

SDF的質量可通過持水性和膨脹性等理化性質進行評估. 在最佳的提取條件下得到褐藻 SDF， 其膨脹力和持水力分別為(53.7±0.4)mL/g和(24.6±0.3)g/g， 可見復合酶提取后的褐藻SDF具有良好的持水力和膨脹力. 高持水性可增加糞便質量， 高膨脹力可增加糞便體積， 從而刺激腸道達到促進排便的功效[13-14].

2.4 褐藻SDF抗氧化測定結果

不同質量濃度褐藻SDF與對照藥維生素C(VC)的DPPH·自由基清除率如圖 6所示. 由圖6可見， 當質量濃度為 0.5 mg/mL 時， SDF的DPPH·自由基清除率可達75.77%， 表明高質量濃度SDF對 DPPH·自由基有較強的清除能力.

***P<0.01差異極顯著； **P<0.05差異顯著.

ABTS·自由基的清除能力是一種重要的抗氧化能力評價標準， 當存在抗氧化物時， 其溶液顏色變淺， 734 nm處的吸光值降低， 吸光值越小樣品的抗氧化能力越強. 不同質量濃度褐藻SDF與對照藥2,6-二叔丁基對甲酚(BHT)的ABTS·自由基清除率如圖7所示. 由圖7可見， 褐藻SDF質量濃度越大， ABTS·自由基清除能力越強[15]， 且二者呈正相關， 當質量濃度為160 μg/mL時， 與對照藥BHT無顯著性差異.

***P<0.01差異極顯著; **P<0.05差異顯著; *P>0.05無顯著差異.

對ABTS·與DPPH·自由基的清除能力是評價樣品抗氧化能力的常用方法. 抗氧化能力與細胞衰老和炎癥有關[16]， 表明褐藻SDF在抗衰老和抗炎方面具有潛在的應用價值.

綜上所述， 本文使用復合酶提取褐藻 SDF， 其最佳條件為75 min的酶解時間, 2.2%的加酶量, 55 ℃的酶解溫度, 1∶25的固液比. 該條件下褐藻SDF提取率最大為38.15%， 持水力和膨脹力分別為(24.6±0.3)g/g和(53.7±0.4)mL/g. 當褐藻SDF質量濃度為0.5 mg/mL時， DPPH·自由基清除率為75.77%； 當褐藻SDF質量濃度為160 μg/mL時， 與對照藥BHT對ABTS·自由基的清除率已無顯著性差異. 可見， 通過復合酶提取褐藻SDF， 其提取率較高， 具有良好的持水力、 膨脹力和抗氧化活性.