基于網絡藥理學研究6-姜辣素改善L6成肌細胞糖脂代謝紊亂的作用機制

曾 顏，田珈瑜，詹權操，劉宇哲，李 冬，王 尚*，王建偉*

1重慶醫科大學基礎醫學院；2重慶醫科大學中醫藥學院 中醫藥防治代謝性疾病重慶市重點實驗室，重慶 400016

糖脂代謝紊亂作為代謝性疾病的重要特征，嚴重危害人類健康。隨著高脂肪或高糖飲食的迅速增加，肥胖、糖尿病、高血壓、血脂異常、非酒精性脂肪肝[1]、動脈粥樣硬化等與糖脂代謝相關的疾病引起了越來越多的關注。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)是糖脂代謝的主要核心病理之一，普遍存在于糖脂代謝異常患者中。骨骼肌是機體能量代謝的重要場所，是機體消耗葡萄糖的主要器官，胰島素刺激所致的葡萄糖攝取與脂肪酸的消耗約80%是由骨骼肌完成的，因此骨骼肌組織在胰島素抵抗中占有重要地位，是調節糖脂代謝的關鍵外周組織[2]。研究顯示[3]，肌肉線粒體供能障礙、脂肪酸攝入增加及氧化減少，與脂質沉積、IR、2型糖尿病(T2DM)等糖脂代謝紊亂相關疾病關系密切。以游離脂肪酸刺激L6大鼠成肌細胞建立糖脂代謝紊亂模型已經應用于多種降糖降脂潛在藥物的評價工作中[4,5]。然而，由于糖脂代謝調控機制復雜，藥物治療作用靶點單一且存在不良反應風險，因此，尋找安全、有效且全面改善糖脂代謝紊亂的藥物是臨床醫師一直致力解決的難題。傳統中醫藥在防治糖脂代謝紊亂方面具有明顯的特色和優勢，具有多靶點、多通路、聯合增效、協同交互等的特點。

中醫學認為，糖脂代謝紊亂相關疾病屬于消渴、脾癢、痰濁、疲血、癥痕、積聚范疇，是一組以臟腑功能失調，津液失于輸化導致的綜合癥。血脂血糖猶如營血津液，為水谷化生的精微物質，生理情況下，臟腑功能健全，水谷精微貫注血脈，溫煦肌膚，濡養臟腑百骸。過食肥甘醇酒厚味、久坐久臥損傷脾氣，脾不散精，精氣不能上歸于肺而朝百脈，水谷精華留滯不化，土塞木郁，郁而化熱，耗氣傷津，清氣不升，濁陰不降，聚濕生痰，留而成疲，痰濁、癖因阻遏經絡臟腑導致血糖血脂升高，這是糖脂代謝紊亂相關疾病的基本病因病機。生姜為姜科植物姜(ZingiberofficinaleRosc)的根莖。姜為世界上最常用的調味料之一，也是世界傳統醫學中最常用的草藥之一。中醫認為，生姜味辛能散，歸脾、胃、肺經，能溫中散寒，燥濕消痰，在調理脾胃，治療痰濕的方藥中被廣泛應用。生姜能夠改善脂質代謝，具有較好的降血脂作用，生姜中的6-姜辣素在降血脂方面有較高的生物活性。本課題組前期研究表明，6-姜辣素能明顯改善高果糖所致以及衰老相關大鼠脂肪肝、脂質異位沉積、線粒體功能、高甘油三酯血癥及胰島素敏感性[6]。Pournaderi等[7]發現6-姜辣素作為生姜主要的活性成分，在抗炎抗氧化方面有著顯著的效果。Algandaby等[8]指出6-姜辣素的抗炎作用可以防治大鼠的肝纖維化。Saravanan等[9]研究指出6-姜辣素通過調控脂質分布，調節胰島素、瘦素、淀粉酶和脂肪酶的含量從而減輕高脂飲食誘導的肥胖。

雖然已有大量文獻報道指出6-姜辣素可改善糖脂代謝紊亂，但其具體作用的靶點和機制尚不明確。隨著生物信息學的發展，基于網絡藥理學探究藥物作用靶點已成為新興的研究熱點，本研究通過網絡藥理學與體外實驗相結合的方法，以高果糖高油酸誘導的L6大鼠成肌細胞為研究對象，探討6-姜辣素治療糖脂代謝紊亂的作用靶點和機制。

1 材料與方法

1.1 6-姜辣素相關靶點篩選

運用TCMSP[10]數據庫和SwissTargetPrediction[11]數據庫篩選6-姜辣素作用靶點，6-姜辣素的SMILES格式在PubChem[12]數據庫獲取，并查找已發表文獻對未篩選出的靶點進行補充。合并2個數據庫靶點后，刪除重復數據，利用Uniprot[13]蛋白標準化數據庫對6-姜辣素相關靶點進行統一轉化。

1.2 糖脂代謝紊亂相關靶點篩選

以“glycolipid metabolism disorder”為關鍵詞，通過GeneCards[14]數據庫篩選目標靶點，以GeneCards數據庫relevance score > 0.1選取目標靶點，查找已發表文獻對未篩選出的靶點進行補充。

1.3 6-姜辣素-糖脂代謝紊亂靶點的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡構建

為明確6-姜辣素藥物靶點與糖脂代謝紊亂靶點的相互關系，通過Cytoscape 3.7.1軟件分析得到關鍵蛋白基因，以度(degree)>平均值(約5.84)將所得交集靶點導入STRING數據庫，構建蛋白PPI網絡圖。

1.4 6-姜辣素-糖脂代謝紊亂靶點富集分析

利用R包對靶點分子進行基因本體(GO)、京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集，得到核心靶點的分子功能(molecular functions，MF)、生物過程(biological processes，BP)、細胞組分(cellular components，CC)及KEGG信號通路，整理后導入Cytoscape 3.7.1軟件進一步可視化分析。

1.5 KEGG Mapper映射

使用KEGG Mapper對富集基因進行基因映射。

1.6 L6細胞體外實驗驗證

1.6.1 細胞株、試劑及儀器

L6細胞株(中國上海吉凱基因)；6-姜辣素(上海源葉生物科技有限公司，貨號B21838)；油酸、油紅、果糖(美國Sigma公司，貨號分別為O1008、O0625、F3510)；TG檢測試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司，貨號E1013)；胎牛血清(美國Gemini公司，批號A58G00J)；DMME培養基(美國Gibco公司，批號8121437)；胰蛋白酶、青/鏈霉素、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司，貨號：C0201、ST488、P0013B、P0010)；RNAiso Plus、轉錄試劑盒、SYBR Premix(中國大連TAKARA公司，貨號：9109、RR047A、RR820A)；羊抗兔、羊抗鼠、IL-1β抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：BA1054、BA1050，A00101-1)；TNF-α抗體(沈陽萬類生物科技有限公司，貨號WL01581)、GAPDH抗體(美國Bioworld 公司，貨號AP0063)、AKT抗體、p-AKT抗體、p-mTOR抗體、ERK抗體、p-ERK抗體、p-NF-κB-p65抗體、β-actin抗體(美國CST公司，貨號:3063S、4060S、5536t、4695S、4370S、3033S、4970S)；mTOR、NF-κB-p65、PI3K(美國Abcam公司，貨號:ab2732、ab194921、ab191606)。

垂直電泳裝置(型號PowerpacTMBasic，美國BIO-RAD公司)；Touch RT-PCR儀(型號CFX96，美國BIO-RAD公司)；全自動酶標儀(型號Syneyy HTX，基因有限公司)；高速冷凍離心機(型號icEN-24R、杭州奧盛儀器有限公司)；Odyssey Fc雙色紅外熒光成像系統(型號Odyssey FC，美國LI-COR公司)；正置熒光顯微鏡(型號U-HGLGPS，日本Olympus公司)。

1.6.2 實驗細胞株的培養

L6大鼠成肌細胞加入10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及0.1 mg/mL鏈霉素的DMEM培養基置于37 ℃恒溫5% CO2細胞培養箱培養，待生長至70%～80%時，換為含2%馬血清的DMEM培養基進行誘導分化。每隔一天換液培養，待其生長至80%長出肌管，說明得到分化成熟的骨骼肌細胞。

1.6.3 油紅染色

在24孔板中鋪入生長狀態良好的大鼠成肌細胞，待密度為70%～80%，換為2%的馬血清培養，待其80%長出肌管,對細胞進行饑餓處理12 h后，加入含10%胎牛血清的培養基進行培養作為對照組(control，Con)，加入果糖(25 mmol/L)油酸(100 μmol/L)作為模型組(model，M)，在其基礎上加入6-姜辣素(10 μmol/L)作為給藥組(6-gingerol，G)，于細胞培養箱孵育；24 h后取出細胞，PBS洗5次，每次5 min；多聚甲醛固定30 min，PBS再洗5次，每次5 min；異丙醇孵育2 min，油紅染色17 min，流水沖洗；加入異丙醇分色20 s，流水沖洗；蘇木素染色30 s，流水沖洗，甘油封片，鏡下觀察。

1.6.4 TG測定

將生長狀態良好的L6大鼠成肌細胞種植于6孔板，分組情況參照“1.6.3”，按照普利萊TG測定試劑盒操作，做3次實驗重復。

1.6.5 IL-1β、TNF-α蛋白水平檢測

細胞分組及藥物干預按照“1.6.3”，6孔板培養細胞，藥物干預24 h，棄去培養基，用PBS清洗兩次，加入胰蛋白酶置于細胞培養箱消化30 s，培養基終止消化，800 r/min離心5 min，加入PBS清洗細胞沉淀，重復兩次，每孔細胞加入300 μL RIPA裂解液，采用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE電泳，轉膜后，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉2 h，封閉結束后，與對應的一抗稀釋液4 ℃孵育過夜。第二天用TBST洗膜4次，每次10 min。加入辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。孵育結束后，用TBST洗膜4次，每次10 min。洗膜完成后，采用ECL化學發光顯色法顯影，實驗結果采用ImageJ軟件進行分析。

1.6.6 RT-PCR檢測PI3K-AKT通路相關基因表達

收集細胞，按照試劑盒提取總RNA，用NanoDrope 2000檢測RNA含量和純度，逆轉錄為cDNA，然后按照10 μL反應體系，循環條件：95 ℃，30 s預變性；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，共40個循環檢測。以β-actin作為內參，數據采用2-ΔΔCt法對目的基因進行相對定量分析。引物序列詳見表1。

表1 實時熒光定量 PCR 相關基因引物序列

1.6.7 Western blot檢測PI3K-AKT通路相關蛋白表達

參照方法“1.6.5”。

1.6.8 統計學分析

2 結果

2.1 6-姜辣素和糖脂代謝紊亂相關靶點的獲取

運用TCMSP數據庫、SwissTargetPrediction數據庫檢索6-姜辣素目標靶點，得到117個靶點。通過GeneCards數據庫獲取糖脂代謝紊亂相關的14 971個作用靶點。

2.2 6-姜辣素-糖脂代謝紊亂靶點PPI網絡構建

將6-姜辣素的117個靶點與糖脂代謝紊亂相關的14 971個靶點取交集，繪制Venn圖得到113個共同靶點(見圖1)；將交集靶點提交至STRING數據庫，得到6-姜辣素靶點PPI網絡(見圖2)。并按照其“度”值從高到低排序，取其排名前30名，關鍵的靶基因有TP53、MAPK3、CASP3、mTOR、PI3K(見圖3)。

圖1 6-姜辣素靶點與疾病靶點韋恩圖

圖2 6-姜辣素靶點與糖脂代謝紊亂靶點的PPI網絡

圖3 6-姜辣素與糖脂代謝紊亂靶點交集

2.3 GO與KEGG富集分析

對PPI網絡涉及蛋白質進行GO和KEGG富集分析，結果顯示主要參與的生物學過程包括蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、蛋白質酪氨酸激酶活性、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、PI3K活性G蛋白偶聯胺受體活性等；參與的主要分子功能包括胰島素受體底物結合、磷酸酶結合、激素結合、蛋白磷酸酶結合等；參與的通路主要包括PI3K-AKT信號通路、自噬、乙、丙型肝炎、人類巨細胞病毒感染等(見圖4)。

圖4 6-姜辣素治療糖脂代謝紊亂靶點的KEGG富集分析

2.4 6-姜辣素治療糖脂代謝紊亂的靶點在PI3K-AKT信號通路中的映射

為進一步了解藥物靶點的相關性，使用KEGG Mapper將有效靶點映射在PI3K-AKT信號通路上，結果表明6-姜辣素靶向PI3K-AKT通路上的15個蛋白，包括PI3K、AKT、mTOR、ERK、NF-κB-p65等(見圖5)。

圖5 6-姜辣素治療糖脂代謝紊亂靶點在PI3K-AKT通路中的映射

2.5 TG測定和油紅染色結果

與對照組相比，模型組甘油三酯含量顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，給藥組甘油三酯含量明顯降低(P<0.01)，油紅染色和甘油三酯變化趨勢一致。表明6-姜辣素可以改善高果糖高油酸造成L6細胞的脂質沉積，結果見圖6。

圖6 L6細胞的TG含量和油紅染色

2.6 大鼠成肌細胞的IL-1β、TNF-α蛋白表達水平

與對照組相比，模型組IL-1β、TNF-α表達顯著上調(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，給藥組IL-1β、TNF-α表達上調(P<0.05，P<0.01)。提示6-姜辣素降低了高果糖高油酸引起的L6細胞的炎癥反應(見圖7)。

圖7 6-姜辣素對IL-1β、TNF-α蛋白的影響

2.7 6-姜辣素對大鼠成肌細胞PI3K-AKT通路相關基因的影響

與對照組相比，AKT的mRNA含量在模型組顯著下調(P<0.01)；與模型組相比，給藥組AKT的mRNA含量上調(P<0.05)，其他基因在模型組和給藥組間無差異(見圖8)。

圖8 6-姜辣素對PI3K-AKT通路基因水平的影響

2.8 6-姜辣素對大鼠成肌細胞PI3K-AKT通路相關蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組p-AKT表達顯著下調(P<0.01)；與模型組相比，給藥組p-AKT、PI3K表達上調(P<0.05)。與對照組相比，p-mTOR、p-ERK、p-NF-κB-p65表達上調；與模型組相比，給藥組p-mTOR、p-ERK、p-NF-κB-p65表達下調(見圖9)。

圖9 6-姜辣素對PI3K-AKT信號通路相關蛋白表達的影響

3 討論與結論

糖脂代謝紊亂是由遺傳、環境、精神、飲食等多種因素參與的疾病，其機制主要涉及神經-內分泌-免疫紊亂、胰島素抵抗、氧化應激、炎性反應、腸道菌群失調等，并以高血糖、血脂失調、脂肪肝、超重、高血壓、動脈粥樣硬化等單一或合并出現為主要臨床表現[15]。本研究通過構建6-姜辣素-糖脂代謝紊亂基因調控網絡，發現PI3K-AKT信號通路與6-姜辣素靶點密切相關，進一步通過基因映射發現PI3K-AKT通路、mTOR、ERK、NF-κB-p65可能是6-姜辣素發揮作用的重要靶點。

PI3K-AKT信號通路是胰島素作用下激活的主要信號轉導通路，胰島素激活該通路后，誘導其下游蛋白級聯反應，參與糖脂代謝[16]。PI3K激活AKT，AKT磷酸化下游底物，這些底物參與調節多種細胞功能，包括凋亡、代謝和細胞周期進程[17]。當機體處于IR狀態時，該信號通路的轉導也受到影響，相關功能轉導途徑減弱或受阻，通路中胰島素受體底物(IRS)、PI3K、AKT蛋白質磷酸化水平表達下調。PI3K-AKT通路受損與肥胖的發展和糖脂代謝紊亂有關。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組AKT基因水平和蛋白磷酸化下調；與模型組相比，給藥組AKT基因水平、蛋白磷酸化水平上調；PI3K基因在各個組間沒明顯差異，與模型組相比，給藥組PI3K蛋白水平顯著上調。這提示6-姜辣素可能通過調節PI3K-AKT通路克服胰島素信號通路的損傷改善糖脂代謝紊亂。mTOR是一種289 kD絲氨酸/蘇氨酸激酶，是PI3K-AKT的下游通路[18]，是細胞生長所必需的營養物質和代謝過程之間的重要分子連接。研究表明[19]，在高脂環境中，mTOR的磷酸化水平升高，抑制mTOR的磷酸化能夠促進自噬信號通路的激活改善胰島素抵抗，從而改善糖脂代謝紊亂。Yu等[20]證明6-姜辣素抑制p-mTOR的表達。本研究結果顯示，與對照組相比，模型組p-mTOR上調；與模型組相比，給藥p-mTOR下調，提示6-姜辣素可能抑制mTOR的磷酸化來改善糖脂代謝紊亂。

Nishi等[21]發現長期的脂質代謝失衡會導致外周器官異位脂肪分布(脂毒性)，包括腎臟、心臟和骨骼肌，從而加速外周炎癥和疾病。研究表明，脂質在骨骼肌的異位沉積能促進炎癥的發生[22]。近年來，越來越多的證據表明，慢性低度炎癥與糖脂代謝紊亂(如胰島素抵抗、明顯肥胖和2型糖尿病)之間存在潛在聯系，這些疾病與炎癥因子產生異常有關。炎性細胞因子水平升高可影響胰島素和脂質信號分子，從而引起糖脂代謝紊亂。Longo等[23]亦發現可通過改善組織中的炎癥和胰島素敏感性改善糖脂代謝紊亂。研究表明[24]，炎癥細胞因子的基因轉錄及表達需要活化核轉錄因子κB(NF-κB)，其中NF-κB的活化與絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase，MAPK)有關。NF-κB是與氧化應激相關的真核細胞轉錄因子，p65是涉及NF-κB激活的一個重要亞基[25]。激活的NF-κB進入細胞核并誘導許多基因的表達，這些基因涉及先天性和適應性免疫調節、細胞粘附、炎癥反應和抗細胞凋亡機制[26]。MAPK通路在炎癥反應中扮演著重要角色，其中包括p38 MAPK、ERK介導的級聯反應，該信號通路的激活與NF-κB通路激活引起的TNF-α等炎性因子的釋放增多有關，從而加劇炎癥反應[27]。目前多個體內體外試驗均表明生姜的有效成分通過抑制NF-κB、MAPK磷酸化發揮強大的抗炎作用[28]，NF-κB能夠介導調節多種炎癥介質，包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等。研究亦證明從食用生姜中提取的6-姜辣素具有抗炎作用[29]。本研究發現，與對照組相比，模型組中IL-1β、TNF-α、p-ERK、p-NF-κB-p65蛋白水平上調；給藥后逆轉了這一情況，表明6-姜辣素可能通過調控ERK、NF-κB-p65的翻譯后水平，阻斷促炎因子IL-1β、TNF-α，降低炎癥反應改善糖脂代謝紊亂。

綜上所述，6-姜辣素能夠抑制ERK、NF-κB-p65蛋白的磷酸化從而降低炎癥反應并通過調控PI3K/AKT/mTOR軸改善胰島素抵抗。本研究闡明了6-姜辣素治療糖脂代謝紊亂的潛在作用靶點，為6-姜辣素的臨床應用提供了理論基礎。