支氣管內(nèi)光學(xué)相干斷層成像技術(shù)評(píng)估兔創(chuàng)傷性氣道狹窄類型的診斷價(jià)值

劉月紅，蔣軍紅，劉子謚，楊振宇，王昌國(guó)，曾大雄，奚杰峰

（1.蘇州大學(xué)附屬獨(dú)墅湖醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，江蘇 蘇州 215006；2.南微醫(yī)學(xué)科技股份有限公司，江蘇 南京 210044）

良性氣道狹窄一般是指各種良性病變引起的氣道狹窄，常見(jiàn)病因有支氣管結(jié)核和醫(yī)源性氣道損傷，如：氣管切開(kāi)以及氣管插管、良性氣道腫瘤和氣管軟化癥等[1]。目前的治療手段多為經(jīng)驗(yàn)治療，如：冷凍和球囊擴(kuò)張等，大部分患者經(jīng)治療后癥狀迅速緩解，但遠(yuǎn)期再狹窄發(fā)生率較高[2]。診斷良性氣道狹窄的手段主要有支氣管鏡和影像學(xué)檢查，如：CT 和X 線等[3-4]。狹窄類型主要分為肉芽增生和瘢痕攣縮[2]，判斷是黏膜破壞還是軟骨破壞需要依靠病理組織學(xué)檢查。而良性氣道狹窄的治療手段主要有傳統(tǒng)的外科手術(shù)治療、內(nèi)科介入治療以及藥物治療，針對(duì)不同的病因、狹窄類型、狹窄程度以及疾病的嚴(yán)重程度，應(yīng)制定不同的治療方案。因此，通過(guò)判斷良性氣道狹窄的具體類型，可進(jìn)一步制定相應(yīng)的治療方案。光學(xué)相干斷層掃描（optical coherence tomography，OCT）是一種新型的影像技術(shù)，與傳統(tǒng)X 線、CT、磁共振成像和超聲診斷技術(shù)不同，其是利用光學(xué)干涉的原理，使用近紅外光的回波，通過(guò)測(cè)量光學(xué)回聲路徑的長(zhǎng)度對(duì)生物組織進(jìn)行斷層成像[5]，最早應(yīng)用于眼科。支氣管內(nèi)光學(xué)相干斷層成像技術(shù)（endo-bronchial optical coherence tomography，EB-OCT）將OCT 與內(nèi)鏡相結(jié)合，使OCT 可進(jìn)入活體組織的管腔結(jié)構(gòu)，如：心血管和消化道等[6]，對(duì)管腔壁及周圍組織進(jìn)行探測(cè)成像。近年來(lái)，國(guó)產(chǎn)EB-OCT的成功研發(fā)，為國(guó)內(nèi)學(xué)者研究OCT 成像技術(shù)提供了便捷途徑，其較細(xì)的直徑亦為OCT 在呼吸道疾病中的應(yīng)用提供了可能。本研究中，筆者采取氣管黏膜損傷聯(lián)合軟骨破壞的方法構(gòu)建兔良性氣道狹窄模型，利用南微醫(yī)學(xué)自主研發(fā)的國(guó)產(chǎn)EB-OCT，觀察不同時(shí)間點(diǎn)良性氣道狹窄的圖像及特點(diǎn)，分析良性氣道狹窄成像的圖像特點(diǎn)，探討EB-OCT的診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

選擇健康、4 個(gè)月齡、體重相當(dāng)?shù)男挛魈m大白兔22 只，購(gòu)買并飼養(yǎng)于蘇州湖橋生物科技有限公司的動(dòng)物飼養(yǎng)中心。內(nèi)鏡OCT 儀器來(lái)源于南微醫(yī)學(xué)，OCT 成像特點(diǎn)：成像掃描長(zhǎng)度為30 mm，探測(cè)靈敏度＞110 dB，成像速度為25 fps，分辨率＜10 μm，成像深度為5 mm，縱向分辨率＜10 μm（組織中）。病理標(biāo)本的制作由基爾頓生物科技（上海）有限公司完成。

1.2 兔創(chuàng)傷性氣管狹窄模型的建立

建立兔創(chuàng)傷性氣管狹窄模型。實(shí)驗(yàn)流程[7]見(jiàn)圖1。

圖1 兔創(chuàng)傷性氣道狹窄模型的建立Fig.1 Establishment of traumatic airway stenosis model in rabbits

1.3 EB-OCT檢測(cè)兔氣管結(jié)構(gòu)

①麻醉好的實(shí)驗(yàn)兔仰臥，固定，吸氧，經(jīng)口氣管插管；②經(jīng)氣管插管將電子支氣管鏡插入氣道，EB-OCT成像導(dǎo)管經(jīng)支氣管鏡工作通道進(jìn)入氣管，啟動(dòng)OCT 的三維自動(dòng)掃描程序進(jìn)行掃描；③留取EB-OCT圖像。分別獲取建模術(shù)前10只正常兔的氣管EB-OCT 圖像，以及建模術(shù)后2、4、6 和8 周狹窄形成的12 只創(chuàng)傷兔氣管EB-OCT 圖像（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只）。見(jiàn)圖2和3。

圖2 采集建模手術(shù)前正常實(shí)驗(yàn)兔氣管EB-OCT圖像及病理組織圖像的流程圖Fig.2 Flow chart of tracheal EB-OCT image and pathological tissue image of normal experimental rabbits before modeling operation

1.4 兔氣管標(biāo)本HE染色

成功獲取正常兔及狹窄兔氣管EB-OCT 圖像后，立即處死實(shí)驗(yàn)兔，留取完整氣管，使用福爾馬林固定標(biāo)本，石蠟包埋固定并切片。脫蠟后水化，再使用蘇木素-伊紅染色，封片后，通過(guò)顯微鏡拍照采集相關(guān)部分病理圖像。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

在支氣管鏡下定位建模手術(shù)部位相同鐘點(diǎn)方向的EB-OCT圖像與病理組織學(xué)圖像，將兩者稱為匹配圖像，使用OCT 自帶的測(cè)量程序，測(cè)量定位部位EB-OCT 圖像中軟骨層和非軟骨層的厚度，標(biāo)記為O-C （cartilage） 和O-NC （non-cartilage），采 用Camera Measure 軟件測(cè)量匹配部位病理組織學(xué)圖像中軟骨層和非軟骨層的厚度，標(biāo)記為H-C和H-NC，將所測(cè)得的數(shù)據(jù)用MedCalc 16.2.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表示兩者存在相關(guān)性，使用相關(guān)性系數(shù)r檢驗(yàn)相關(guān)性，|r|＞0.95表示兩者顯著性相關(guān)。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，使用方差分析來(lái)判斷正常兔和創(chuàng)傷兔軟骨層及非軟骨層厚度的變化，P＜0.01為差異極其顯著，使用Fisher 確切概率法比較支氣管鏡下、EB-OCT 以及病理組織學(xué)觀察狹窄形成類型的差異。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 采集建模術(shù)后實(shí)驗(yàn)兔氣管EB-OCT圖像及病理組織圖像的流程圖Fig.3 Flow chart of tracheal EB-OCT image and pathological tissue image of the experimental rabbit after modeling operation

2 結(jié)果

2.1 正常實(shí)驗(yàn)兔氣管EB-OCT圖像特點(diǎn)

正常實(shí)驗(yàn)兔的氣管EB-OCT圖像呈現(xiàn)為層次分明和信號(hào)強(qiáng)弱不等的灰階圖，筆者按信號(hào)強(qiáng)度依次標(biāo)記為O1～O4，將病理組織圖像按層次標(biāo)記為H1～H4。O1與病理組織學(xué)的H1（黏膜層）相對(duì)應(yīng)，O2與病理組織學(xué)的H2（黏膜下層）相對(duì)應(yīng)，O3與病理組織學(xué)的H3（平滑肌層）相對(duì)應(yīng)，O4 與病理組織學(xué)的H4（軟骨層）相對(duì)應(yīng)。EB-OCT 圖像中，黏膜層信號(hào)偏弱，表現(xiàn)為灰色，黏膜下層信號(hào)最強(qiáng)，表現(xiàn)為強(qiáng)反射的白色，平滑肌層信號(hào)偏強(qiáng)，表現(xiàn)為灰白色，軟骨信號(hào)最弱，表現(xiàn)為黑色。見(jiàn)圖4。

圖4 正常兔氣管EB-OCT和病理圖片F(xiàn)ig.4 EB-OCT and pathological images of normal rabbit trachea

2.2 創(chuàng)傷兔氣管EB-OCT圖像特點(diǎn)

建模成功的創(chuàng)傷兔，術(shù)后2 周的氣管EB-OCT 圖像特點(diǎn)：可見(jiàn)強(qiáng)信號(hào)反射條帶的黏膜層和黏膜下層增厚，部分向內(nèi)隆起，低信號(hào)反射的軟骨層結(jié)構(gòu)斷裂、不連續(xù)，管腔明顯狹窄；術(shù)后4 周管腔狹窄最嚴(yán)重，氣管結(jié)構(gòu)紊亂，表現(xiàn)為強(qiáng)弱信號(hào)混合，層次不清（圖5）；術(shù)后6 周管腔黏膜和軟骨開(kāi)始修復(fù)，氣管結(jié)構(gòu)分界清楚，軟骨層結(jié)構(gòu)不連續(xù)，狹窄有所減輕；術(shù)后8 周進(jìn)一步修復(fù)，管腔狹窄程度進(jìn)一步減輕，各層次結(jié)構(gòu)完整，按信號(hào)強(qiáng)弱劃分各層次分界清楚。

圖5 創(chuàng)傷兔術(shù)后4周支氣管鏡、EB-OCT和病理圖片F(xiàn)ig.5 Bronchoscopy,EB-OCT and pathological images of injured rabbits 4 weeks after operation

2.3 狹窄形成的類型

EB-OCT觀察到12只創(chuàng)傷兔狹窄形成的類型分別為：?jiǎn)渭凁つて茐? 例，黏膜合并軟骨破壞9 例；病理組織學(xué)診斷為：?jiǎn)渭凁つて茐?例，黏膜合并軟骨破壞10 例，兩種診斷方法比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 EB-OCT及病理組織學(xué)兩種診斷方法的相關(guān)性

研究EB-OCT及病理組織學(xué)兩種診斷方法測(cè)量軟骨層和非軟骨層厚度的相關(guān)性，結(jié)果顯示：使用兩種診斷方法測(cè)量，獲得的創(chuàng)傷兔軟骨層及非軟骨層的厚度較正常兔均明顯增厚（P＜0.01），術(shù)后2 周增厚最為明顯，隨著時(shí)間的推移，觸發(fā)創(chuàng)傷的修復(fù)，各層次厚度逐漸減?。ǜ奖恚＼浌菍雍头擒浌菍雍穸葍煞N診斷方法的相關(guān)性，呈高度相關(guān)，相關(guān)曲線分別是：軟骨層Y=3.7498+0.9717X，r=0.9992（P＜0.01）；非軟骨層Y=-9.4328+0.9935X，r=0.9999（P＜0.01）。正常氣管結(jié)構(gòu)各層相關(guān)曲線見(jiàn)圖6。

圖6 兩種診斷方法相關(guān)性的曲線圖Fig.6 Graph of the correlation between the two diagnostic methods

附表 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)軟骨層及非軟骨層厚度的平均值 （μm，±s）Attached table Mean thickness of cartilage layer and non-cartilage layer at each time point （μm，±s）

附表 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)軟骨層及非軟骨層厚度的平均值 （μm，±s）Attached table Mean thickness of cartilage layer and non-cartilage layer at each time point （μm，±s）

時(shí)間點(diǎn)正常兔（n=10）術(shù)后2周（n=3）術(shù)后4周（n=3）術(shù)后6周（n=3）術(shù)后8周（n=3）F值P值H-NC 444.6±70.4 1 000.4±96.9 943.9±242.8 611.4±46.5 606.7±69.8 10.70 0.001 O-NC 456.3±24.7 1 020.0±98.1 957.7±242.5 624.0±47.0 619.3±70.0 12.04 0.001 H-C 332.8±32.1 484.5±25.4 472.0±79.0 508.1±1.4 351.9±19.1 18.99 0.000 O-C 352.0±34.2 494.0±28.5 485.0±82.2 516.0±0.3 359.7±19.6 12.04 0.001

3 討論

良性氣道狹窄是呼吸介入學(xué)中的常見(jiàn)病，由于我國(guó)結(jié)核病高發(fā)，氣道狹窄發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)[8]，亦是氣管插管和氣管切開(kāi)術(shù)后最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一[9]，且治療后的再狹窄發(fā)生率高，因治療頻次多，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存期。因此，研究良性氣道狹窄的發(fā)病機(jī)制，可早期預(yù)防及干預(yù)，提高治療效果[10-14]。

自1991年美國(guó)學(xué)者提出OCT 的概念，近年來(lái)其已廣泛應(yīng)用于眼科和皮膚科等領(lǐng)域[15]。EB-OCT 是一種可應(yīng)用于人體管腔結(jié)構(gòu)的新型成像技術(shù)，其分辨率較高，可達(dá)微米級(jí)別。早在2005年，KARAMZADEH等[16]建立人工氣管插管致使兔氣管損傷模型，并使用EB-OCT 對(duì)損傷兔氣道進(jìn)行掃描成像，初步證實(shí)EB-OCT可應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)，其成像圖可顯示實(shí)驗(yàn)兔氣管損傷后的氣道結(jié)構(gòu)變化。隨后，國(guó)外有學(xué)者[17-19]將EB-OCT 應(yīng)用于人體氣道，經(jīng)過(guò)探索研究發(fā)現(xiàn)：OCT具有分辨率高、實(shí)時(shí)和可測(cè)量等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)提供了EB-OCT在判斷氣道結(jié)構(gòu)方面的可能性。

2014年南微醫(yī)學(xué)研發(fā)了國(guó)產(chǎn)EB-OCT三維成像系統(tǒng)，該系統(tǒng)將OCT 的探頭與球囊相結(jié)合，直徑較細(xì)，內(nèi)鏡下操作方便，適用于活體組織的管腔結(jié)構(gòu)（如血管、食道、胃腸道和氣管等），且該成像系統(tǒng)有著超高的分辨率，其縱向分辨率是臨床上使用的超聲支氣管鏡（endobronchial ultra-sound，EBUS）的10～15 倍，在生物組織中可達(dá)到6 至7 μm，其橫向分辨率是傳統(tǒng)OCT 內(nèi)鏡探頭的2 倍以上，成像最大深度為5 mm[20]，可對(duì)活體生物組織進(jìn)行高分辨率、高靈敏度、無(wú)創(chuàng)和實(shí)時(shí)的三維成像。為了獲取南微醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)的EB-OCT 在診斷肺部疾病方面的數(shù)據(jù)，探索其在氣道相關(guān)疾病中的診斷價(jià)值，筆者開(kāi)展了一系列動(dòng)物研究，為其在后續(xù)的臨床應(yīng)用中提供參考依據(jù)。

筆者使用南微醫(yī)學(xué)開(kāi)發(fā)的新型EB-OCT三維成像系統(tǒng)，記錄創(chuàng)傷兔良性氣道狹窄形成的過(guò)程，并采集相關(guān)圖像，分析總結(jié)氣管鏡下圖像與病理組織學(xué)及EB-OCT 圖像的相關(guān)性。大量研究[21-24]表明，氣管黏膜有再生功能，氣道的創(chuàng)傷和修復(fù)的觸發(fā)點(diǎn)是軟骨膜的損傷，僅黏膜損傷，一般無(wú)狹窄形成[21-22]。軟骨破壞是氣道狹窄形成的主要因素。臨床上，支氣管結(jié)核、氣管插管、氣管切開(kāi)術(shù)后以及氣道良性腫瘤的患者，常常伴有氣道黏膜損傷，還同時(shí)存在軟骨破壞，在氣道黏膜再生和創(chuàng)傷修復(fù)過(guò)程中可形成肉芽和瘢痕，進(jìn)而導(dǎo)致氣道狹窄[25]。因此，在建立實(shí)驗(yàn)兔良性氣道狹窄模型時(shí)，筆者既使用尼龍刷損傷氣道黏膜，又用血管鉗破壞氣道軟骨。在多次預(yù)實(shí)驗(yàn)后，筆者將建模術(shù)后2、4、6 和8 周定為觀察時(shí)間點(diǎn)，記錄不同時(shí)間點(diǎn)氣管鏡下實(shí)驗(yàn)兔氣道狹窄形成的類型，同時(shí)使用EB-OCT 進(jìn)行掃描，采集每個(gè)時(shí)間點(diǎn)創(chuàng)傷兔的EB-OCT圖像。為確保所得數(shù)據(jù)的可靠性，筆者在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)選擇EB-OCT 圖像較為典型的3只實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行解剖，取出完整氣道組織，做成病理切片，使用顯微鏡拍照，采集相關(guān)的病理組織圖片。使用OCT 自帶軟件，測(cè)量EB-OCT圖像中軟骨層及非軟骨層的厚度，同時(shí)測(cè)量病理組織圖像中相對(duì)應(yīng)部分的厚度，用MedCalc 軟件處理所獲得的數(shù)據(jù)，并進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：軟骨與非軟骨結(jié)構(gòu)的兩種診斷方法呈線性正相關(guān)，證實(shí)了EB-OCT圖像與病理組織學(xué)圖像高度匹配。筆者通過(guò)EB-OCT和病理組織學(xué)獲得實(shí)驗(yàn)兔氣道狹窄圖像，分析圖像特點(diǎn)并進(jìn)行相關(guān)性分析，比較氣管鏡下、EB-OCT和病理組織學(xué)觀察到的兔良性氣道狹窄的形成率和狹窄形成的類型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3種手段所觀察到的兔氣道狹窄形成率一致，狹窄形成的類型主要為：肉芽增生和瘢痕攣縮；證實(shí)了兔良性氣道狹窄形成的關(guān)鍵因素是：氣管內(nèi)黏膜損傷以及軟骨破壞。EB-OCT所觀察到的實(shí)驗(yàn)兔良性氣道狹窄的形成率和形成類型與氣管鏡下表現(xiàn)及病理組織學(xué)一致，說(shuō)明：使用EB-OCT動(dòng)態(tài)觀察兔良性氣道狹窄形成過(guò)程是可行的，其價(jià)值與無(wú)創(chuàng)的氣管鏡檢查和有創(chuàng)的病理組織學(xué)相當(dāng)，且其較氣管鏡和病理組織學(xué)有實(shí)時(shí)和分辨率高的優(yōu)勢(shì)。

綜上所述，國(guó)產(chǎn)EB-OCT具有無(wú)創(chuàng)、實(shí)時(shí)和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)，其對(duì)良性氣道狹窄的診斷價(jià)值與氣管鏡檢查和病理組織學(xué)相當(dāng)，可進(jìn)一步應(yīng)用于研究良性氣道狹窄形成的機(jī)制，以便后期服務(wù)于臨床，解決良性氣道狹窄的預(yù)防和早期干預(yù)等相關(guān)問(wèn)題，為今后治療良性氣道狹窄提供參考依據(jù)。