豬偽狂犬病病毒野毒株的分離鑒定及gC、gD基因序列分析

呂玉金 ， 趙攀登 ， 張世軍 ， 劉玲玲 ， 李文剛 ， 王湘如 ， 陳煥春 ， 吳鳳筍

(1. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 河南 鄭州 450046 ； 3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 湖北 武漢 430070)

偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科的成員，主要引起多種家畜及野生動(dòng)物的急性、熱性傳染病[1]。自19世紀(jì)發(fā)現(xiàn)PRV以來(lái)，由于其宿主范圍廣、致病性強(qiáng)、變異速度快以及目前還沒(méi)有有效的治療措施等，給多個(gè)國(guó)家的養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大挑戰(zhàn)[2-3],尤其從2011年底PRV變異毒株的出現(xiàn)[4]，使偽狂犬病的防控變得愈加困難。

本試驗(yàn)對(duì)2019年采集的河南省某規(guī)?；i場(chǎng)疑似偽狂犬病毒野毒感染的組織病料進(jìn)行病毒的分離、鑒定和純化，測(cè)定分離毒株的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)、一步生長(zhǎng)曲線和動(dòng)物回歸試驗(yàn)，并對(duì)分離毒株的gC和gD基因進(jìn)行測(cè)序和序列分析。

1 材料與方法

1.1 組織病料 2019年1月從河南省某豬場(chǎng)無(wú)菌采集疑似感染PRV的病死豬的腦、腎臟、脾臟、肺臟、肝臟等組織，于-80 ℃保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7周齡雌性BALB/c小鼠，購(gòu)自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.3 主要試劑 SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、HiPure Viral RNA/DNA Kit抽提試劑盒、SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒等，均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司；rTaq酶、dNTPs、DNA Marker DL5 000、核酸電泳染料等，均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 引物的設(shè)計(jì)與合成 采用本實(shí)驗(yàn)室保存的PRV的鑒定引物(P2017)對(duì)病料組織提取的DNA進(jìn)行擴(kuò)增鑒定；此外，根據(jù)GenBank已公布的PRV全基因序列(登錄號(hào)：JF797219.1)，使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物，分別用于gC和gD基因的擴(kuò)增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物具體信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.5 樣品處理 將采集的病料組織混合剪碎，按照約5∶1加入DMEM培養(yǎng)基充分研磨后反復(fù)凍融3次，離心后取上清液，經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾，過(guò)濾液于-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 病毒DNA提取及病原PCR檢測(cè) 將處理過(guò)的組織濾液用HiPure Viral RNA/DNA Kit提取試劑盒提取病毒DNA，以提取的DNA為模板進(jìn)行PRV鑒定。

1.7 病毒的分離與純化 將處理過(guò)的組織濾液接種至生長(zhǎng)良好的PK-15細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)盲傳，待細(xì)胞病變(Cytopathic effect，CPE)達(dá)到80%時(shí)收毒。用0.05% 中性紅溶液對(duì)病毒進(jìn)行3輪空斑純化后，在PK-15細(xì)胞上傳代至穩(wěn)定出現(xiàn)CPE時(shí)收毒，用PCR方法進(jìn)行病毒鑒定。

1.8 病毒TCID50和一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行病毒TCID50和一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。將病毒在PK-15細(xì)胞上連續(xù)傳代至穩(wěn)定出現(xiàn)明顯CPE，收取病毒液，用含2%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行10倍倍比稀釋后，分別接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立陰性孔作為對(duì)照，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行觀察記錄。采用Reed-Muench法計(jì)算TCID50。

將病毒液用DMEM維持液稀釋至感染復(fù)數(shù)(MOI)為1，接種于PK-15細(xì)胞上，37 ℃孵育1 h后用PBS清洗3次，加入含2% FBS的DMEM細(xì)胞維持液，放入5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)2、4、8、12、24、36、48、60、72、84 h和96 h時(shí)收樣，收樣后加入500 μL含2% FBS的DMEM細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)。對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)收取的樣品進(jìn)行TCID50的測(cè)定，以病毒效價(jià)為縱坐標(biāo)，感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，利用GraphPad Prism 8.0軟件繪制一步生長(zhǎng)曲線。

1.9 分離毒株對(duì)小鼠的致病性 將36只BALB/c雌性小鼠(7周齡)隨機(jī)分成6個(gè)組，每組6只。取已知TCID50的PRV用DMEM細(xì)胞維持液連續(xù)做10倍梯度稀釋?zhuān)?個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度病毒液注射1組小鼠(6只)，最后1組注射DMEM細(xì)胞維持液作為陰性對(duì)照。注射方式均采用腹部皮下注射，每只小鼠注射100 μL。隨時(shí)觀察小鼠臨床癥狀及死亡數(shù)量和時(shí)間，并記錄觀察情況，直至小鼠不再出現(xiàn)明顯的臨床癥狀和死亡。根據(jù)小鼠的死亡情況，按照 Reed-Muench法計(jì)算分離毒株對(duì)BALB/c小鼠的半數(shù)致死量(Median lethal dose，LD50)。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行病理剖檢，取部分臟器組織進(jìn)行研磨提取基因組DNA，按照本實(shí)驗(yàn)室所建立的PRVgE和gB基因TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)感染小鼠臟器中病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行測(cè)定[5]。

1.10 分離毒株gC和gD基因擴(kuò)增 以1.6中提取的病毒DNA作為模板，進(jìn)行g(shù)C、gD基因擴(kuò)增，擴(kuò)增條件見(jiàn)表2、表3。擴(kuò)增的目的基因經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠回收后與pMD-18T載體連接，而后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

表2 PRV gC基因擴(kuò)增體系和程序

表3 PRV gD基因擴(kuò)增體系和程序

1.11 分離毒株gC和gD基因序列分析 將所得序列測(cè)定結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，并與GenBank中已收錄的國(guó)內(nèi)外其他PRV流行株的gC、gD基因進(jìn)行比較，用 MEGA 7.1.0 軟件構(gòu)建基因進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果

2.1 病原PCR檢測(cè) 以從組織病料中提取的病毒基因組DNA為模板，用PRV鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到1條約166 bp的陽(yáng)性條帶，與陽(yáng)性對(duì)照Bartha-K61株的條帶大小一致(圖1)。

圖1 組織病料PCR鑒定

2.2 病毒的分離純化 將收取的病毒液用0.05%中性紅溶液對(duì)病毒進(jìn)行空斑純化，如圖2。空斑純化后擴(kuò)大培養(yǎng)的病毒液用PCR方法進(jìn)行病毒鑒定，結(jié)果擴(kuò)增出1條約166 bp的特異性條帶，如圖3，與預(yù)期結(jié)果一致。結(jié)果顯示，成功分離到1株P(guān)RV毒株，將其命名為HNCY。

圖2 病料組織PRV分離株空斑試驗(yàn)

圖3 空斑純化病原的PCR鑒定

2.3 分離株毒株TCID50和一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定 取空斑純化的F9、F10、F11代病毒液分別做病毒滴度測(cè)定，取每個(gè)病毒液稀釋度出現(xiàn)細(xì)胞病變孔的3次試驗(yàn)平均值。按照Reed-Muench法計(jì)算出分離毒株HNCY的TCID50為10-8.48/0.1 mL。

取F9代病毒液在PK-15細(xì)胞上測(cè)定一步生長(zhǎng)曲線，以收樣時(shí)間為橫坐標(biāo)，病毒的TCID50的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行一步生長(zhǎng)曲線的繪制，如圖4，分離株呈現(xiàn)常規(guī)增殖規(guī)律，12～24 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，48 h達(dá)到最高，之后病毒滴度逐漸降低。

圖4 PRV分離株的一步生長(zhǎng)曲線

2.4 分離毒株對(duì)小鼠的致病性

2.4.1 分離毒株對(duì)小鼠致病性試驗(yàn) 將分離株病毒液進(jìn)行倍比稀釋后，經(jīng)腹部皮下接種小鼠，觀察其臨床狀態(tài)以及死亡情況。結(jié)果顯示，試驗(yàn)組小鼠在接毒36 h后出現(xiàn)精神沉郁、呼吸加快、奇癢、啃咬和抓撓注射部位等癥狀。最早出現(xiàn)死亡的是102稀釋度組在攻毒后60 h，隨后的48 h內(nèi)小鼠死亡率達(dá)到高峰，攻毒后144 h小鼠不再出現(xiàn)死亡，臨床癥狀消失。小鼠詳細(xì)的死亡情況見(jiàn)表4。按照Reed-Muench法計(jì)算病毒的LD50為104.14TCID50。

表4 PRV分離株LD50的測(cè)定

2.4.2 分離毒株感染小鼠組織臟器中PRV載量的檢測(cè) 結(jié)果見(jiàn)圖5，肺組織中含毒量最高，其次是腦、腎臟、脾臟和心臟等組織。

圖5 PRV gE和gB基因在小鼠內(nèi)臟組織中定量分布

2.5 分離毒株gC和gD基因的擴(kuò)增 對(duì)PRVgC和gD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠回收后與pMD-18T載體連接，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，PRVgC質(zhì)粒酶切得到2條大小分別約1 750 bp和2 640 bp的條帶，PRVgD質(zhì)粒酶切得到2條大小分別約1 367 bp和2 640 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖6)。

圖6 PRV gC、gD基因的PCR擴(kuò)增

2.6 分離毒株gC、gD基因核苷酸和氨基酸序列同源性分析 分離毒株HNCY株gC、gD基因核苷酸和氨基酸與歐美毒株和國(guó)內(nèi)PRV分離毒株進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果如表5、表6所示，HNCY株與國(guó)內(nèi)分離株同源性要高于歐美毒株，且gC基因與2011年之后分離的國(guó)內(nèi)變異株同源性更高。

表5 HNCY株gC、gD基因與參考毒株核苷酸序列同源性比對(duì)

表6 HNCY株gC、gD基因與參考毒株氨基酸序列同源性比對(duì)

2.7 分離毒株gC、gD基因氨基酸進(jìn)化分析 根據(jù)GenBank中已發(fā)表的14株國(guó)內(nèi)外PRV參考毒株，運(yùn)用MEGA 7.1.0軟件通過(guò)Neighbor-Joining方法對(duì)gC、gD基因氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。gC基因氨基酸進(jìn)化樹(shù)顯示，HNCY-gC(●)與歐美毒株(◆)在不同的大分支上，親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，與國(guó)內(nèi)分離株在同一分支上，與2011年之前分離的毒株(■)在不同的小分支上，與2011年之后分離的毒株在同一分支上，表明HNCY株與2011年之后分離的毒株親緣關(guān)系較近；gD基因氨基酸進(jìn)化樹(shù)顯示，HNCY-gD(●)與歐美毒株(◆)在不同的大分支上，與國(guó)內(nèi)分離株在同一分支上，表明HNCY株與國(guó)內(nèi)分離的毒株親緣關(guān)系較近；gC、gD基因氨基酸進(jìn)化樹(shù)分析表明，HNCY株與國(guó)內(nèi)2011年之后分離的毒株親緣關(guān)系較近。

圖7 HNCY株gC(A)、gD(B)基因遺傳進(jìn)化分析

3 討論

PRV是危害養(yǎng)豬業(yè)較嚴(yán)重的病原之一[4,6-7]。自2011年以來(lái)，隨著PRV的遺傳進(jìn)化和變異使得傳統(tǒng)疫苗的保護(hù)率下降[8-10]，豬偽狂犬病有暴發(fā)和流行的趨勢(shì)。2018 年Sun等[11]調(diào)查了2012—2017年我國(guó)27個(gè)省份的PRV分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)全國(guó)PRV 的平均陽(yáng)性率為8.27%。趙勝杰等[12]對(duì)2019年河南省規(guī)?；i場(chǎng)豬偽狂犬病病毒gE基因進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，gE抗體平均個(gè)體陽(yáng)性率為26.69%，豬場(chǎng)群陽(yáng)性率為53.60%。

本試驗(yàn)從河南某豬場(chǎng)進(jìn)行采樣，采用組織病料PCR檢測(cè)、細(xì)胞培養(yǎng)、蝕斑純化、病毒TCID50測(cè)定、一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定等方法成功分離出1株P(guān)RV野毒株，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)活性研究，說(shuō)明河南地區(qū)有PRV野毒株流行，這與顧陽(yáng)[13]和張中華[14]的報(bào)道基本一致。從免疫過(guò)Bartha-K61疫苗的豬場(chǎng)中分離出PRV，表明該豬場(chǎng)所使用的疫苗不能為豬群提供針對(duì)PRV流行毒株感染的有效保護(hù)。該分離株在PK-15細(xì)胞進(jìn)行純化后傳代培養(yǎng)，其TCID50為10-8.48/0.1 mL，這與翟瑤等[15]所分離出的PRV培養(yǎng)滴度相差10倍，說(shuō)明不同PRV分離株在PK-15細(xì)胞上的生長(zhǎng)特性以及感染力存在差異，這可能與PRV吸附、侵染、復(fù)制、組裝和釋放功能的相關(guān)基因存在變異有關(guān)。通過(guò)小鼠試驗(yàn)測(cè)定分離毒株的致病性和LD50，結(jié)果顯示，HNCY分離株的LD50為104.14TCID50，小鼠感染后出現(xiàn)精神沉郁、呼吸加快、撕咬注射部位、死亡等臨床癥狀；剖檢后小鼠脾臟、肺臟、腎臟、腦等組織均有不同程度的淤血、出血、水腫甚至壞死等病理變化；熒光定量PCR檢測(cè)臟器病毒載量，顯示肺組織中含毒量最高，其次是腦、腎臟、脾臟、心臟等組織，說(shuō)明分離毒株對(duì)小鼠具有較強(qiáng)的致病性。

gC基因是PRV 基因序列中相對(duì)保守的基因，該基因的變異可導(dǎo)致PRV 生物學(xué)特性的改變，促使PRV 逃避感染宿主的免疫防御機(jī)制。2020年袁獻(xiàn)宇等[16]對(duì)分離的15 株P(guān)RV與2011 年前國(guó)內(nèi)分離的PRV毒株序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，gC基因存在多個(gè)位點(diǎn)的變化，包括替換、插入或缺失。2020年鞠厚斌等[17]對(duì)2010—2015 年分離的15株P(guān)RV 的gD基因進(jìn)行核苷酸和氨基酸序列同源性對(duì)比，同源性分別為99.7%～100% 和99.2%～100%；gC基因核苷酸和氨基酸序列同源性分別為94.9%～100% 和99.2%～100%。

本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)HNCY分離株的gC、gD基因進(jìn)行序列測(cè)定，并與GenBank中其他PRV流行株進(jìn)行同源性和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示，HNCY毒株gC基因與國(guó)內(nèi)外其他毒株核苷酸同源性為95.9%～100.0%，其中與歐美毒株的同源性為95.9%～96.2%，而與2011年以后國(guó)內(nèi)分離毒株同源性為99.9%～100.0%；氨基酸序列同源性比核苷酸同源性稍低，HNCY毒株gC基因與歐美毒株的同源性僅為92.9%～93.1%，與2011年之后國(guó)內(nèi)分離毒株的同源性為99.8%～100.0%；HNCY毒株gD基因與其他毒株的核苷酸同源性為98.9%～100.0%，其中與歐美毒株的同源性為98.9%～99.3%，與國(guó)內(nèi)分離的毒株同源性為99.5%～100.0%。HNCY毒株gC基因與歐美毒株及2011年以前分離的毒株不在同一分支上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；HNCY毒株gD基因與歐美毒株不在同一大分子上，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與2011年以后分離的毒株在同一分支上，親緣關(guān)系較近，本結(jié)果與2020年鞠厚斌等[17]分離毒株gC、gD基因氨基酸和核苷酸對(duì)比結(jié)果相似。

綜上所述，HNCY分離株gC、gD基因與國(guó)內(nèi)毒株的同源性均高于歐美毒株，且HNCY株gC基因與2011年之后的國(guó)內(nèi)毒株同源性均高于2011年之前分離的國(guó)內(nèi)毒株，生長(zhǎng)特性、致病性與經(jīng)典毒株偽狂犬病毒閩A株(Fa)和偽狂犬病毒鄂A株(Ea)也基本一致，說(shuō)明HNCY分離株屬于國(guó)內(nèi)變異株。