蚯蚓源貝萊斯芽孢桿菌Y1鑒定及生物學特性研究

郭藝偉 ， 劉依山 ， 包永占 ， 潘興亮 ， 王玉田 ， 鄭瑞峰

(1.河北農業大學動物醫學院 ， 河北 保定 071000 ； 2. 北京市畜牧總站 ， 北京 朝陽 100107)

抗生素治療動物疾病的高效性使其在養殖過程中占著舉足輕重的地位。近年來，抗生素濫用[1]導致耐藥菌株出現，破壞生態系統，影響畜禽產品品質，人類作為動物源性食品的終端消費者，身體健康受到損害，因此迫切需要尋找替抗物質。益生菌是近年來的研究熱點之一，其主要通過提高飼料營養的利用率、免疫調節能力及調節腸道環境等為宿主動物機體健康發揮益生作用[2-3]。芽孢桿菌作為飼用益生菌[4]，具有增殖快、抗逆性強、抗菌譜廣、生物安全性高，在惡劣環境中產生孢子，能分泌豐富的酶類及產生抗菌活性很強的次級代謝產物等優勢，有促生長、調節腸道微生態平衡、抗菌、提高抵抗力的作用。貝萊斯芽孢桿菌是2005年被西班牙學者發現的一種新型生防菌[5]，目前被廣泛用于生防[6]、化工、醫療、洗滌等領域[7-8]，尤其在植物健康[9]與病蟲害防控方面研究較廣，但應用于畜禽的研究很少[10]。本試驗通過對貝萊斯芽孢桿菌的益生特性研究，分析其成為潛在的益生菌應用于畜禽生產的可能性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 指示菌：大腸埃希菌，ATCC25922-G2；金黃色葡萄球菌，ATCC6538-G2。蚯蚓，采自北京市奧林匹克公園；SPF級KM小鼠，購自斯貝福(北京)生物技術有限公司。

1.2 主要儀器 生化培養箱、恒溫振蕩器，均購自上海博訊實業有限公司醫療設備廠；酶標儀，購自賽默飛世爾(上海)儀器有限公司；PCR儀，購自上海坤科儀器設備有限公司；凝膠成像系統，購自普若森生物科技(上海)有限公司。

1.3 主要試劑 VETEC瓊脂粉、藥敏試紙片，均購自美國賽默飛世爾科技(中國)有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶，均購自南京建成生物科技有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌株分離純化及鏡檢 將蚯蚓置于75%酒精中做體表消毒，沿其體表剪開在LB培養基上涂布，培養12～24 h，將培養出的細菌純化2～3代，將單菌落接入LB液體培養基培養12～18 h，將該分離菌命名為Y1，觀察Y1菌的顏色、形態等。對培養12 h的Y1菌進行革蘭染色并在光學顯微鏡下鏡檢，利用成像系統拍照；使用掃描電鏡Hitachi SU8010進行菌體形態觀察。

1.4.2 生理生化鑒定 根據《常見細菌系統鑒定手冊》和《伯杰氏細菌鑒定手冊》(9版)對Y1菌的種屬進行初步鑒定。

1.4.3 分子生物學鑒定 對Y1菌進行16S rRNA基因序列測序，PCR擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，利用MEGA 7.0軟件構建其系統進化樹。

1.4.4 繪制生長曲線 將Y1菌按1%的接種量接種于LB液體培養基，200 r/min培養30 h，每隔3 h取樣并檢測菌液OD600值，以時間t為橫坐標、OD600值為縱坐標繪制Y1菌的生長曲線。

1.4.5 胃腸液耐受試驗 人工胃液、人工腸液按照《中國藥典》2015年版第四部[11]配制。取菌懸液分別加到人工胃液和人工腸液中，180 r/min培養10 h，每隔2 h取樣進行平板菌落計數，計算存活率。存活率(%)=Nt/N0×100%，其中Nt為結束時的活菌數，N0為起始時的活菌數。

1.4.6 膽鹽耐受試驗 將菌懸液按1%接種量接種到含有0.3%牛膽鹽的液體培養基中，以不含牛膽鹽的試管作為對照管，培養10 h，每隔1 h取樣，測定OD600值，繪制生長曲線。

1.4.7 藥敏試驗 將含有定量抗生素的藥敏紙片(直徑為6 mm)，放在涂有菌液的培養基表面，培養24 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.4.8 體外抑菌試驗 試驗方法參照牛津杯法[12]，37 ℃培養12 h，觀察并測量抑菌圈直徑。

1.5 動物安全性試驗 對照組與試驗組各5只小鼠，試驗組小鼠飼喂新鮮菌液，對照組常規飼養，觀察記錄小鼠的精神、行動、體重、食欲、排泄等變化。

2 結果

2.1 菌株分離純化及鏡檢 如圖1所示，Y1菌在TSA培養基上的菌落呈黃色，圓形，表面濕潤，不透明，邊緣整齊，在液體培養基形成薄菌膜；鏡檢菌體為短桿狀，可產生芽孢。

圖1 Y1菌的菌落形態、革蘭染色鏡檢和掃描電鏡結果

2.2 生理生化鑒定 結果見表1，Y1菌能夠利用葡萄糖、甘露醇、D-棉子糖、果糖、麥芽糖、古老糖、D-海藻糖、D-核糖；能水解淀粉和七葉苷，產生明膠酶和過氧化氫酶，能在6.5%的氯化鈉中生長；不能產生硫化氫，不能利用L-鼠李糖、D-松三糖和D-半乳糖。

表1 Y1菌生理生化鑒定結果

2.3 分子生物學鑒定 Y1菌的16S rRNA基因序列目的條帶電泳結果如圖2所示，基因片段約為1 500 bp。 將Y1菌16S rRNA序列在NCBI數據庫進行比對發現，Y1菌與多個芽孢桿菌基因序列匹配度較高(圖3)。將Y1菌GyrB基因序列進行比對，又與其近種序列進行相似性比較后發現，其與貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis)的同源性最高，相似率達99.93%(圖4)。

圖2 Y1菌16S rRNA基因的PCR擴增

圖3 Y1菌16S rRNA序列系統發育樹

圖4 Y1菌GyrB基因序列系統發育樹

2.4 生長曲線分析 對Y1菌生長進行檢測，如圖5所示，Y1菌遲緩期很短，6～12 h為對數期，15～27 h處于穩定期且時間較長，27 h后進入衰退期。

圖5 Y1菌生長曲線

2.5 耐胃腸液分析 結果如表2所示，Y1菌在人工胃腸液中活菌數隨孵育時間延長呈逐漸遞減趨勢，孵育10 h的活菌數顯著降低(P<0.05)，Y1菌在人工胃液、腸液中培養10 h存活率分別達到60.40% 和61.60%，說明Y1菌對人工胃液和人工腸液有較好的耐受性，能夠抵御胃蛋白酶和胰蛋白酶的破壞。

表2 Y1菌耐人工胃、腸液結果

2.6 耐膽鹽分析 Y1菌在含有0.3%膽鹽的培養基中生長呈遞增趨勢(圖6)，隨著孵育時間延長活菌數顯著增高(P<0.05)(表3)，表明Y1菌對0.3%膽鹽有較好的耐受性，而動物小腸中膽汁鹽含量波動范圍在0.03%～0.3%，說明Y1菌可以在腸道中存活。

表3 Y1菌耐膽鹽結果

圖6 Y1菌耐膽鹽結果

2.7 藥敏試驗分析 由表4可知，Y1菌對環丙沙星、頭孢羥氨芐、氟苯尼考、替米考星和慶大霉素高度敏感，尤其是頭孢羥氨芐，其抑菌直徑可達到40 mm；對氨芐西林、羥氨芐青霉素和青霉素G耐藥，說明Y1菌對大多數β-內酰胺類藥物都有抗性。

表4 Y1菌藥敏試驗結果

2.8 抑菌特性分析 Y1菌對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌都有顯著抑制效果(圖7)。對大腸埃希菌的抑菌圈直徑達到(21.33±1.53)mm(P<0.05)，對金黃色葡萄球菌可達(15.67±1.53)mm(P<0.05)，如表5所示。

圖7 Y1菌對大腸埃希菌(A)和金黃色葡萄球菌(B)抑菌結果

表5 抑菌試驗結果

2.9 動物安全性試驗 試驗組小鼠均未出現死亡或患病情況，精神狀態和行為活動均正常，被毛良好不粗糙，采食、飲水、排泄均正常，證明分離菌株安全。

3 討論

本試驗從蚯蚓體內篩選細菌時發現1株生長快、菌落大且周圍不長霉菌的芽孢桿菌，經16S rRNA基因序列鑒定及生理生化試驗確定該菌為貝萊斯芽孢桿菌。動物胃腸道菌群隨著胃腸液的pH變化而變化，同時胃腸液內又含有胃蛋白酶、胰蛋白酶、膽鹽等物質，貝萊斯芽孢桿菌Y1若在胃腸道增殖，就要耐受胃腸道環境，保證有足夠的活菌數發揮作用。本試驗結果顯示，Y1菌6～12 h增殖較快，12～27 h生長穩定，且對胃腸液和膽鹽的耐受效果較好，能抵御消化道胃蛋白酶、胰蛋白酶和膽汁的破壞，保證了Y1菌在腸道內能夠迅速增殖，為其在畜禽腸道發揮作用提供時間基礎。相比劉韶娜等[13]研究的貝萊斯芽孢桿菌B13在16～24 h處于穩定期，Y1菌的穩定期更長；高艷俠等[14]研究表明貝萊斯芽孢桿菌LF01在不同鹽度下均于14～16 h達到穩定期，Y1菌的穩定期比其更長；表明Y1菌在腸道內有足夠的時間增殖并產生酶類及次級代謝產物，從而發揮調節腸道微生態環境的作用。

在畜禽養殖過程中，抗生素濫用造成了耐藥菌株的產生，益生菌是一種優質飼料添加劑，益生菌與抗生素若要聯合使用必須考慮兩者有無拮抗作用。本試驗結果顯示，貝萊斯芽孢桿菌Y1對環丙沙星、頭孢羥氨芐、氟苯尼考、替米考星和慶大霉素高度敏感，在飼喂畜禽益生菌添加劑時應避免使用此類敏感藥物；對羥氨芐青霉素、青霉素G、氨芐西林不敏感，兩者可以配合使用。張小波等[15]分離的鴨源貝萊斯芽孢桿菌GZZY2019同樣對青霉素和氨芐西林耐藥。貝萊斯芽孢桿菌Y1是否攜帶對β-內酰胺類抗生素的耐受基因還有待研究。

本試驗結果顯示，Y1菌能抑制大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌的生長繁殖。劉韶娜等[13]研究表明，貝萊斯芽孢桿菌B13不僅能抑制這2種細菌，還對鼠傷寒沙門菌有抑制效果，且能提高豬腸道內乳桿菌屬等益生菌的相對豐度，顯著降低鏈球菌屬等條件致病菌的相對豐度[16]，相比之下Y1菌對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果要優于B13菌。Nannan等[17]從雞糞中分離的貝萊斯芽孢桿菌CN026對大腸埃希菌、腸炎沙門菌、空腸彎曲桿菌和李斯特菌均有抑制作用。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌發揮抑菌作用的物質主要為脂肽類抗生素、抗菌肽、聚酮類化合物[18]，Y1菌的抑菌活性物質還有待發掘。本試驗為貝萊斯芽孢桿菌Y1應用于畜禽生產提供理論支持，其有望成為一種潛在的益生菌添加劑。