3種細胞穿透肽對體外轉錄mRNA的遞送效果

王軍華 ， 羅畫葉 ， 張翠玲 ， 李軍偉

(青島農業大學動物醫學院 ， 山東 青島 266109)

mRNA疫苗是近年來發展的一種新型疫苗，相對于傳統疫苗和DNA疫苗，mRNA疫苗具有多方面優勢，包括：在胞質中自我表達；不能整合到細胞的基因組上；具有誘導細胞免疫應答的能力，制備成本低，生產周期僅需要1個月左右[1-3]。mRNA疫苗必須到達靶細胞的細胞質內才能被表達，但由于mRNA不穩定，易被細胞質中的RNA酶降解，如果直接注射裸露的mRNA進入機體，會很快被降解，達不到預期的免疫效果；如果采用物理方法遞送，細胞會受到物理傷害，導致細胞死亡。因此，如何安全遞送外源性的mRNA并提高其表達效率便成為近年來mRNA疫苗研究領域的熱點和難點，而設計高效的遞送載體成為mRNA疫苗研究的核心問題。研究發現，細胞穿透肽(Cell-penetrating peptides，CPPs)可以結合帶負電荷的RNA分子，而從狂犬病病毒糖蛋白(Rabies virus glycoprotein，RVG)中提取的含有29個氨基酸殘基的多肽片段是一種很有前景的細胞穿透肽，因此，本試驗比較了來源于狂犬病病毒糖蛋白的細胞穿透肽RVG及其衍生物RVG9dR、RVG11dR對體外轉錄mRNA的遞送效果。

1 材料與方法

1.1 質粒、細胞、實驗動物、細胞穿透肽、主要試劑 質粒pVax1-EGFP、質粒pVax1、293T細胞由本實驗室保存；7周齡BALB/c雌鼠，購自山東省實驗動物中心；3種細胞穿透肽：RVG、RVG9dR、RVG11dR(序列見表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；MEGAscriptTMT7 Transcription Kit、LiCl Precipitation Solution、Lipofectamine 2000轉染試劑，均購自賽默飛世爾科技公司；E.coliPoly(A) Polymerase、Vaccinia Capping System，均購自NEB(北京)有限公司；DMEM培養液、MEM培養液、胰酶、胎牛血清、非必需氨基酸(100×)，均購自Gibco公司。

表1 3種細胞穿透肽序列

1.2 mRNA的體外轉錄 設計引物，通過PCR擴增綠色熒光蛋白mRNA(mRNA-EGFP)的體外轉錄模板(T7-EGFP-1F:TAATACGACTCACTATAGGGA；T7-EGFP-900R：AGGAAAGGACAGTGGGAGT),按照轉錄試劑盒說明書進行體外轉錄獲得初始mRNA, 使用氯化鋰(LiCl)溶液進行純化，按照加帽加尾試劑盒說明書進行加帽加尾的修飾后再次使用LiCl進行純化，獲得能夠穩定表達的mRNA-EGFP，并用Lipofectamine 2000在293T細胞上進行轉染，24 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光表達情況，證明獲得的mRNA在細胞內有功能。

1.3 凝膠阻滯試驗 測定mRNA-EGFP濃度后，將1 μg mRNA-EGFP與RVG按照4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶4和 1∶8的質量比例混合；另將1 μg mRNA-EGFP與RVG9dR按照2∶1、1∶1、1∶2、1∶4、1∶8和1∶16的質量比例混合；再將1 μg mRNA-EGFP與RVG11dR按照8∶1、4∶1、2∶1、1∶1、1∶2和1∶4的質量比例混合，室溫靜置20 min，分別進行電泳，利用紫外凝膠成像系統觀察分析結果。

1.4 細胞毒性試驗 在75 cm2細胞培養瓶中培養293T細胞，待細胞長滿單層時，將細胞用胰酶消化、懸浮后鋪在96孔細胞培養板，每個孔加入100 μL細胞懸液，每孔的細胞密度達到4×103個/孔，將培養板放入37 ℃、5% CO2細胞培養箱中過夜培養。將3種細胞穿透肽設置相同的試驗梯度，分別為0.01、0.1、1、10 μmol/L和100 μmol/L，每組重復3次；加入配制的混合液放入細胞培養箱孵育24 h；每孔加入20 μL MTT溶液，繼續培養4 h；吸棄上清，每孔加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，室溫下靜置20 min，使結晶物充分溶解；酶聯免疫檢測儀在OD490 nm處測量各孔的吸光值，利用Prism軟件進行數據比較分析。

1.5 RNA酶保護試驗 在6孔板內每孔平鋪1×106個 293T細胞，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中過夜培養。試驗前1 h，將6孔板內原培養液棄掉，用PBS磷酸鹽緩沖液清洗293T細胞2次除去血清；每孔中加入1 mL Opti-MEM培養基，置于37 ℃細胞培養箱。取滅菌后的1.5 mL離心管6個，分別加入100 μL Opti-MEM，1～3號加入1 μg mRNA-EGFP，4～6號加入10 μg RVG、8 μg RVG9dR、6 μg RVG11dR，將1～3號對應加到4～6號離心管中，室溫靜置5 min后，將二者混合均勻室溫靜置20 min；向靜置后的4～6號離心管中各加入2 μL RNase A，于37 ℃的水浴鍋中溫育20 min；取出6孔板，將標記為4～6號的離心管混合液加入到相應6孔板中，添加空白對照孔；培養7 h后，將Opti-MEM無血清培養基替換為正常的培養基，繼續培養24 h，使用倒置熒光顯微鏡觀察試驗結果并拍照。

1.6 細胞熒光試驗 在6孔板內每孔平鋪1×106個 293T細胞，置37 ℃、5% CO2細胞培養箱中過夜培養。試驗前1 h，將6孔板內原培養液棄掉，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗293T細胞2次除去血清。試驗分為 3個組，第1組：RVG 8 μg、10 μg、12 μg； 第2組：RVG9dR 6 μg、8 μg、10 μg；第3組：RVG11dR 4 μg、6 μg、8 μg，各組分別轉染1 μg mRNA-EGFP, 并設置1個空白對照孔，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養7 h，將Opti-MEM無血清培養基替換為正常的培養基,繼續培養24 h，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色熒光情況并拍照。

2 結果

2.1 凝膠阻滯試驗 3種細胞穿透肽RVG、RVG9dR、RVG11dR分別與1 μg mRNA-EGFP以不同的比例混勻，利用紫外凝膠成像系統觀察結果，如圖1所示，mRNA-EGFP與RVG的最適比例為1∶8；mRNA- EGFP與RVG9dR的最適比例為1∶4；mRNA-EGFP 與RVG11dR的最適比例為1∶2。

圖1 3種細胞穿透肽和mRNA-EGFP的凝膠阻滯試驗

2.2 細胞毒性試驗 3種細胞穿透肽RVG、RVG9dR、RVG11dR對293T細胞的細胞毒性結果如圖2所示，3種細胞穿透肽對293T細胞的半抑制濃度(50% inhibiting concentration, IC50)分別是95、90 μmol/L和81 μmol/L,說明在RVG的C末端添加多精氨酸可導致其細胞毒性的增加。

圖2 RVG、RVG9dR、RVG11dR對293T細胞的細胞毒性

2.3 RNA酶保護試驗 分別用RVG、RVG9dR、RVG11dR將mRNA-EGFP包被后，再與RNase A作用后轉染293T細胞，24 h后在倒置熒光顯微鏡觀察，結果如圖3所示，mRNA-EGFP在細胞內都能正常表達，說明3種細胞穿透肽都能保護mRNA-EGFP不被RNA酶所降解。

圖3 RNase A 保護試驗細胞熒光結果

2.4 細胞熒光試驗 根據凝膠阻滯試驗的結果將第1組細胞穿透肽RVG分別以8 μg、10 μg、12 μg與1 μg的mRNA-EGFP作用；將第2組細胞穿透肽RVG9dR分別以6 μg、8 μg、10 μg與1 μg的mRNA-EGFP作用；將第3組細胞穿透肽RVG11dR分別以4 μg、6 μg、8 μg與 1 μg的mRNA-EGFP作用，然后轉染293T細胞，24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察結果，如圖4所示，RVG11dR 6 μg(圖4K)和RVG11dR 8 μg(圖4L)作用的細胞內熒光最強，說明3個細胞穿透肽中，RVG11dR對mRNA-EGFP的轉運效果最好，但是6 μg和8 μg RVG11dR對mRNA-EGFP 的轉運效果基本沒有差別。

圖4 細胞熒光試驗結果

3 討論

mRNA的生產是通過體外轉錄技術獲得，體外轉錄是利用T7、T3或Sp6噬菌體RNA聚合酶以一個線性化的、編碼目的基因mRNA的質粒DNA(Plasmid DNA，pDNA)作為模板進行轉錄后獲得前體mRNA[4]。而本試驗中采用的體外轉錄技術是利用含有T7啟動子的線性化的DNA作為模板，用于體外轉錄的模板至少包含1個啟動子、1個編碼目的基因的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，然后用RNA聚合酶進行轉錄，再用DNA酶消化處理后就可以排除殘留的線性化的DNA[5]。目前，mRNA的體外轉錄技術并不是十分完善，只通過普通的體外轉錄試劑盒轉錄出的mRNA極其不穩定，為了提高其穩定性，需要在前體mRNA的5′端通過5′-5′三磷酸連接1個帽子結構[6]，在轉錄過程中添加帽子類似物有可能轉錄出帶有帽子結構的mRNA， 而本試驗采用的是在轉錄結束后利用加帽試劑盒添加帽子結構[7]，在三磷酸酶、鳥苷基轉移酶和(鳥嘌呤-7-)甲基轉移酶的共同作用下在RNA的5′三磷酸添加1個帽子結構[8]，這可以增加蛋白的表達量，提高mRNA的穩定性，保護其免遭核酸外切酶的攻擊[9]。同時，還需要在前體mRNA的3′端添加一段Poly(A)尾巴結構，可以采用在pDNA后添加1個Poly(A)序列用于轉錄成Poly(A)尾巴，同樣這一步驟本試驗中也采用在轉錄后使用加尾試劑盒進行添加[10]，Poly(A)尾巴可以增強mRNA翻譯效率，提高mRNA的穩定性。經過加帽、加尾之后才能形成具有生物活性的mRNA，進一步提高mRNA的蛋白表達。

細胞穿透肽是一種短肽，在遞送載體中扮演著十分重要的角色，它能夠不依賴特異性膜受體獨立穿過細胞膜，甚至有些細胞穿透肽的入胞并不依賴能量[11]，其具有良好的生物相容性，且細胞毒性小，完成入胞轉運后可降解，并能與生物活性蛋白直接融合進行重組表達[12]。細胞穿透肽的組成和結構多種多樣，因此各類細胞穿透肽穿透細胞膜的方式和效率也各不相同。本試驗中比較了來源于狂犬病糖蛋白的細胞穿透肽以及其衍生物對體外轉錄mRNA的遞送效果。

從狂犬病病毒糖蛋白中提取的含有29個氨基酸殘基的多肽片段RVG，作為一種陽離子細胞穿透肽，除了具有前面介紹的特點之外，它還有獨特的優勢：嗜神經性、血腦屏障通透性和生物安全性。RVG可以穿過血腦屏障(Blood-brain barrier，BBB)進入腦細胞[13]，到目前為止已被證明可以成功地用于攜帶質粒[14]、siRNA[15]、蛋白質[16]和納米顆粒[17]進入腦細胞。有研究表明，含有少精氨酸殘基的嵌合RVG(RVG-9R)可以通過電荷相互作用與siRNA結合，并將其轉運進樹突狀細胞(DCs)從而抑制流感病毒的復制[18]。另有研究發現，RVG-9R融合肽將DNA疫苗靶向轉運進DCs可有效提高針對牛痘和西尼羅河病毒感染的免疫應答，精氨酸的低聚物使其具有更高的穿膜效率[19]，此外，還有研究發現，精氨酸的數量和排列順序對其穿膜能力有著重要的影響[20]。

本試驗合成了來源于狂犬病病毒糖蛋白的細胞穿透肽RVG并設計、合成其衍生物RVG9dR、RVG11dR。結果顯示：3種細胞穿透肽都對mRNA具有一定的包被、保護和遞送效果，其中RVG11dR的包被效果最好、遞送效率最高。有研究證實，帶有29個精氨酸的RVG能夠遞送熒光蛋白到特定細胞內進行表達[21]，因此可以適當增加精氨酸的數量來提高RVG的遞送和保護效果，在本試驗中RVG9dR和RVG11dR對mRNA的遞送效率皆比RVG高，說明在RVG的C末端添加多精氨酸可以提高其對mRNA的包裝與轉運能力，但是細胞毒性試驗結果又表明在RVG的C末端添加多精氨酸也可導致其細胞毒性的增加。研究證明，陽離子脂質體納米顆粒(Lipid nanoparticles，LNPs)可作為高效的遞送小干擾RNA(siRNA)的工具[22]，或許將其與細胞穿透肽結合后會對mRNA的遞送和保護產生積極效果[23]。因此，以后的研究中可以考慮采用將細胞穿透肽與脂質體納米顆粒相結合的方式提高對mRNA的遞送效力。