湖南婁底市犬弓首蛔蟲流行狀況及線粒體cox1和nad4序列變異分析

王先坤 ， 李 靜

(婁底職業技術學院 ， 湖南 婁底 417000)

犬弓首蛔蟲(Toxocaracanis)是一種重要人獸共患性寄生蟲，可感染多種宿主，包括犬、貓和人類等[1]。含2期幼蟲被犬或人類誤食后在小腸內發育為幼蟲，幼蟲穿透腸壁通過血液循環進入各器官(如肺臟和肝臟)，甚至可進入人類神經系統，造成癲癇或失明等[2-3]。犬弓首蛔蟲蟲卵廣泛存在于土壤、天然水(特別是死水)和食品表面，且蟲卵可隨病犬糞便排到外界，犬只體表可被含蟲卵的糞污污染。由于部分兒童缺乏良好的衛生習慣，他們可能通過撫摸寵物犬(甚至是流浪犬)或在小區、公園等地區玩耍而接觸犬弓首蛔蟲蟲卵，繼而造成相應感染[4]。因此，了解地區犬弓首蛔蟲感染情況及環境中蟲卵污染情況對防控該病具有重要意義[5-7]。

目前關于弓首蛔蟲的流行病學調查大多集中于寵物犬，對于流浪犬和環境中犬弓首蛔蟲污染情況的調查研究相對較少，但這對該病的防控十分重要。近年來，湖南婁底市飼養寵物犬家庭比例逐漸上升，外界流浪犬數量也有上升趨勢。婁底市部分季節氣候潮濕，十分利于犬弓首蛔蟲蟲卵的生存，這在一定程度上提高了人類感染犬弓首蛔蟲病的風險。因此，本試驗于2021年3—9月對湖南省婁底市部分地區寵物犬和流浪犬弓首蛔蟲感染情況進行調查；對受試地區附近小區及公園土壤和池塘水樣品中弓首蛔蟲蟲卵污染情況進行檢測；同時對獲得的9個弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列進行擴增和測序，分析其遺傳變異情況，旨在為該病的防控提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料 犬弓首蛔蟲陽性DNA樣品于本實驗室保存；DNA基因組提取試劑盒為天根通用生物技術有限公司產品；DL 2 000 DNA Marker和2×PCR預混液等均為北京瀚海拓新生物技術有限公司產品；PCR儀和移液器等均為美國吉爾森有限公司產品。

1.2 樣品采集 從婁底市婁星區、雙峰縣、新化縣和冷水江市收集犬糞便樣品368份，其中寵物犬糞便樣品(247份)采集于寵物醫院、居民小區和寵物犬養殖基地等，流浪犬糞便樣品(121份)采集于郊區公園和流浪犬收容所。環境樣品(土壤和池塘水樣品共104份)采集于公園和居民小區。記錄每份樣品采樣時間、地點等信息后將其保存于4 ℃。

對部分檢測為犬弓首蛔蟲病陽性犬只進行藥物驅蟲，將形態學鑒定為犬弓首蛔蟲的蟲株標記后保存于70%酒精中。本試驗共獲得9個犬弓首蛔蟲分離株，分別來自于婁星區(LDLX-1、LDLX-2和LDLX-3)、雙峰縣(LDSF-1和LDSF-2)、新化縣(LDXH-1和LDXH-2)和冷水江市(LDLSJ-1和LDLSJ-2)。

1.3 糞便和土壤樣品的犬弓首蛔蟲蟲卵檢測 采用飽和鹽水漂浮法對糞便或土壤樣品中犬弓首蛔蟲蟲卵進行檢測：取3.0 g糞便或土壤樣品置于燒杯內，并加入30 mL 飽和生理鹽水，用玻璃棒充分攪勻后以100目銅篩過濾；于室溫將濾液靜置40 min，用金屬環(直徑為0.5 cm)小心接觸液面，其后將濾膜抖落在載玻片表面，并多次蘸取不同部位濾液，其后用蓋玻片蓋于載玻片上，在光學顯微鏡下觀察是否存在犬弓首蛔蟲蟲卵[8]。

1.4 水樣本的犬弓首蛔蟲蟲卵DNA檢測

1.4.1 DNA基因組提取 將水樣品混勻后取40 mL 置于50 mL離心管內，3 000 r/min離心15 min，棄去上清后再加入40 mL水樣品，重復操作3～4次使沉淀重量達5 g左右，加入適量蒸餾水將沉淀混勻，取200 μL混合液用于DNA基因組提取，其操作步驟嚴格參考試劑盒說明書進行，DNA基因組保存于-20 ℃，待檢。

1.4.2 引物合成及樣品核酸檢測 參照文獻[9]合成檢測犬弓首蛔蟲ATP6 (ATP synthase subunit 6) 基因的特異性引物(PCR產物大小約300 bp)，其序列：ATP6-F1:GTTTGTTGTTTTGGGGGCTA；ATP6-R1:CCAAAGGACGAGAAACCTCA。PCR反應體系(25 μL)： 2×PCR預混液 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板3.0 μL和無菌水8.5 μL，每次PCR反應均設置陽性和陰性對照，其模板分別為已知犬弓首蛔蟲DNA樣品和無菌水。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共35個 循環；72 ℃ 7 min。反應結束后取適量PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統上觀察檢測結果。

1.5 犬弓首蛔蟲線粒體cox1和nad4基因序列擴增

1.5.1 DNA基因組提取 從75%酒精中取出犬弓首蛔蟲蟲株，用蒸餾水沖洗3次，每次5 min。用眼科剪剪取約2 cm蟲體置于2 mL滅菌離心管內，加入適量滅菌蒸餾水和鋼珠進行勻漿；取適量勻漿液用于DNA基因組提取，其操作步驟參考相應的DNA提取試劑盒說明書。

1.5.2 引物合成、PCR擴增及測序 參考文獻[10]合成用于擴增犬弓首蛔蟲線粒體cox1(JB3和JB4.5)基因序列的引物。擴增線粒體nad4所用引物：Nad4-F:ATAATGGAGTTGTTATTATTTTC；Nad4-R:CACCAAAGGAATAGCAAAGC。PCR反應體系(25 μL)：2×PCR預混液 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、DNA模板2.0 μL和無菌水9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(cox1基因)或90 s(nad4基因)，共35個循環；72 ℃ 7 min。取PCR陽性產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序并拼接。

1.6 序列分析 從GenBank數據庫下載具有代表性的犬弓首蛔蟲相關序列，應用DNASTAR軟件分別對蟲株線粒體cox1和nad4核苷酸序列同源性進行比對分析；以DnaSP 5.0軟件分析序列核苷酸多樣性、單倍型多樣性和平均核苷酸差異等；以MEGA 7.0軟件中臨接法(NJ)構建系統進化樹，其模型為Kimura-2-parameter，重復自舉檢測1 000次。

2 結果

2.1 婁底市犬弓首蛔蟲感染情況調查統計 檢測發現部分樣品中存在犬弓首蛔蟲蟲卵，其為黃褐色、圓形蟲卵，且卵殼較厚，外殼表面凹凸不平，符合犬弓首蛔蟲蟲卵形態學特征(圖1)。經統計該地區被調查樣品犬弓首蛔蟲蟲卵平均檢出率為11.86%(56/472)；其中婁星區來源樣品陽性率最高，為16.48%，而雙峰縣最低(6.45%)。不同樣品感染情況統計結果如表1所示，寵物犬來源糞便樣品的犬弓首蛔蟲蟲卵檢出率為11.74%,較流浪犬(17.36%)低；公園和小區土壤樣品中犬弓首蛔蟲蟲卵檢出率分別為9.09%和3.92%；采用PCR法檢測20份被調查水樣品中是否存在犬弓首蛔蟲蟲卵，結果發現僅有1份公園來源水樣品中含有犬弓首蛔蟲蟲卵核酸(圖略)。

表1 婁底市犬弓首蛔蟲感染情況調查

2.2 犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列的PCR擴增 9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因均成功擴增，其片段大小約500 bp和1 200 bp，與預期片段大小相符，無非特異性條帶(圖2)，提示成功擴增出犬弓首蛔蟲的cox1和nad4基因序列。

圖2 犬弓首蛔蟲線粒體cox1和nad4基因的PCR擴增

2.3 測序及同源性分析 對測序結果進行拼接與比對，發現9個分離株線粒體cox1和nad4基因序列分別為424 bp和1 197 bp，其A+T含量分別為61.33%～62.28%和67.47%～67.72%。9個蟲株線粒體cox1和nad4核苷酸序列同源性為99.4%～100.0%和98.7%～100.0%；進一步分析發現，本試驗獲得蟲株cox1和nad4核苷酸序列與已知犬弓首蛔蟲對應序列同源性分別為99.2%～99.7%和98.6%～99.6%；與獅弓蛔蟲(Toxascarisleonina)、人蛔蟲(Ascarislumbricoides)、豬蛔蟲(Ascarissuum)和貍貓弓蛔蟲(Toxocaratanuki)、犬鉤口線蟲(Ancylostomacaninum)對應序列同源性均低于90%。

2.4 遺傳多樣性 本試驗獲得的9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列檢測到單倍型數量分別為4個和5個；其總單倍型多樣性分別為0.792±0.012和0.843±0.013；核苷酸多樣性分別為0.007±0.002和0.006±0.003；平均核苷酸差異分別為1.958和2.062。

2.5 系統遺傳進化分析 將線粒體cox1和nad4基因進行串聯，并用MEGA 7.0軟件中NJ法構建系統進化樹。結果如圖3所示，本試驗獲得的9個犬弓首蛔蟲分離株具有高度同源性，與已知犬弓首蛔蟲分離株(JF780944、MK913433、MT359315和MT942614)在進化樹上位于同一分支；與其他蛔蟲屬相比，犬弓首蛔蟲、獅弓蛔蟲(JF780947)和貍貓弓蛔蟲分離株(AB446546)聚為同一群，與豬蛔蟲(MZ008307)和人蛔蟲分離株(MK792813)所屬分支相隔較遠。上述結果再次證明本試驗獲得分離株為犬弓首蛔蟲。

圖3 基于線粒體cox1和nad4基因串聯序列構建犬弓首蛔蟲系統進化樹

3 討論

犬弓首蛔蟲的終末宿主是犬科動物，其感染性蟲卵可隨患犬糞便排出，從而污染糞污、附近土壤或水源，人類(特別是兒童)可能因接觸被蟲卵污染的糞污、土壤或水源而誤食感染性蟲卵導致患病。因此，對犬只弓首蛔蟲感染情況及環境(土壤和水源)蟲卵污染情況進行調查可初步評估該病原對人類健康的威脅。本試驗結果顯示，婁底市寵物犬弓首蛔蟲蟲卵檢出率較流浪犬低，這可能是由于流浪犬長期缺乏營養導致抵抗力較差，且在外界環境中更容易接觸犬弓首蛔蟲蟲卵，卻無法得到有效藥物驅蟲，導致其感染率較高。總體而言，婁底市犬弓首蛔蟲病感染情況和湖南衡陽市(13.28%)[11]差異較小，但低于重慶市(77.03%)、揚州市(30.65%)和湖南益陽市(54.9%)[12-14]，說明我國不同地區犬弓首蛔蟲病流行情況存在差異，但仍然較為嚴重。值得注意的是，本試驗在犬貓經常出沒的小區和公園土壤樣品中也檢測到了犬弓首蛔蟲蟲卵存在，這與盧祖鵬等[15]的調查結果一致。此外，部分公園池塘水樣品中也存在犬弓首蛔蟲蟲卵，由于小孩在公園或小區內經常接觸土壤或水，可能導致他們接觸到感染性蟲卵，因此對小區和公園環境定期進行打掃和消毒十分必要。

研究表明，線粒體cox1和nad4基因序列可作為鑒定蛔蟲的分子標記[10,16]。本試驗結果顯示，9個弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列種內變異率分別為0.0%～0.6%和0.0%～1.3%，可見犬弓首蛔蟲線粒體nad4基因序列較cox1基因序列堿基變異率更高，與龔騰芳等[17]的研究結果一致[17]。基于線粒體cox1和nad4基因串聯序列構建系統進化樹，結果顯示，本試驗獲得蟲株與已知犬弓首蛔蟲分離株屬于同一分支，與其他蟲株所屬分支相隔較遠，這說明犬弓首蛔蟲cox1和nad4基因種內變異遠低于種間變異，提示線粒體cox1和nad4基因序列可作為犬弓首蛔蟲的分子鑒定標志物。進一步遺傳多樣性分析結果顯示，9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因核苷酸多樣性均低于0.01，分別為0.007±0.002和0.006±0.003，對于絕大部分寄生蟲來說核苷酸多樣性低于0.01被認為變異率較低[16]，故本試驗獲得的犬弓首蛔蟲分離株遺傳變異程度相對較低。

綜上，湖南省婁底市犬(寵物犬和流浪犬)弓首蛔蟲病流行情況相對嚴重，同時在犬只經常出沒的公園和小區環境(土壤和水)樣品中也檢測到犬弓首蛔蟲蟲卵。此外，本試驗獲得的9個犬弓首蛔蟲分離株線粒體cox1和nad4基因序列變異程度和遺傳多樣性均較低，且這2個基因均可作為鑒定犬公首蛔蟲的分子標記。由于該病原的流行對人類健康存在巨大威脅，故相關人員應引起對該病的重視。