真核重組熒光質粒pEGFP-N1-Et HP的構建及高效轉染細胞的篩選

郭許情 ， 王黎霞 ， 張榕珍 ， 張 健 ， 張?zhí)煊?， 石夢云 ， 王詩琪 ， 趙小涵 ， 張建軍 ， 安 健

(1. 北京農(nóng)學院動物科學技術學院 ， 北京 昌平 102206 ； 2. 北京農(nóng)業(yè)職業(yè)學院畜牧獸醫(yī)系 ， 北京 房山 102442)

雞球蟲病是由一種或多種頂復門艾美爾球蟲寄生于雞腸道上皮細胞導致的寄生性原蟲病，對我國的禽養(yǎng)殖業(yè)造成了大量直接或間接的經(jīng)濟損失[1]。在公認的幾種球蟲中，柔嫩艾美爾球蟲(Eimeriatenella)在雞球蟲病中最常見，致病性也最強，且基于柔嫩艾美爾球蟲的研究也較為廣泛。

頂復門原生寄生蟲依賴宿主細胞而存活，它們在入侵過程中通過改變細胞的生命活動促使其能在細胞內(nèi)存活并發(fā)育[2]。而雞球蟲在入侵過程中分泌的相關蛋白成為了阻斷雞球蟲發(fā)育的研究重點，通過各種技術干預這些蛋白的分泌可達到預防雞球蟲病的效果。柔嫩艾美爾球蟲假定蛋白(Eimeriatenellahypothetical protein，EtHP)是一種分泌性蛋白，本課題組推測其在柔嫩艾美爾球蟲入侵過程中存在重要作用[3]，但具體功能尚未深入研究。本試驗構建了真核熒光重組表達質粒pEGFP-N1-EtHP，篩選出高效轉染的細胞，并檢驗其在不同種細胞中的表達情況，為進一步探索EtHP蛋白在柔嫩艾美爾球蟲入侵寄生過程中對細胞生命活動的影響提供有效的試驗工具。

1 材料與方法

1.1 材料 柔嫩艾美爾球蟲第2代裂殖子cDNA，真核熒光表達載體pEGFP-N1，Vero、DF-1、BHK、HD-11細胞，均由北京農(nóng)學院獸醫(yī)學實驗室保存提供；DNA Marker，購自北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶SacI/SacII、T4連接酶，均購自美國NEB公司；無內(nèi)毒素質粒大量提取試劑盒，購自北京索萊寶生物技術公司；LipofectamineTM2000 Transfection Reagent，購自美國賽默飛科技公司；本試驗所使用的抗體，均購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1EtHP基因的克隆 設計引物擴增EtHP基因(JN987269.1)CDS區(qū)，長度為450 bp。EtHP-F序列為：5′-cgagctcatggcggatcagcttaccgag-3′，含有SacI酶切位點；EtHP-R序列為：5′-tccccgcggcttcgcaagcatcattcccacgaactcctca-3′，含有SacII酶切位點。PCR反應結束后進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并膠回收。

1.2.2 真核重組熒光質粒pEGFP-N1-EtHP的構建 同時用SacI和SacII對空質粒與膠回收產(chǎn)物進行雙酶切，回收的pEGFP-N1和EtHP基因酶切片段按比例混合后加入T4連接酶，16 ℃放置過夜后轉化Trans-T1感受態(tài)細胞。選取4個單菌落進行PCR鑒定，提取其中鑒定為陽性的質粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。使用無內(nèi)毒素質粒大量提取試劑盒提取pEGFP-N1-EtHP和pEGFP-N1，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 細胞培養(yǎng) 將凍存的Vero細胞、DF-1細胞、BHK細胞、HD-11細胞復蘇，分別用含5%、15%、10%、15% FBS和均含有1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。傳2～3代，用于后續(xù)試驗。

1.2.4 pEGFP-N1-EtHP的轉染 選取上述4種生長狀態(tài)良好的細胞進行鋪板。24孔板中加入每種對應的完全培養(yǎng)液500 μL/孔，再以細胞密度1×105個/孔鋪被24孔板，每種細胞鋪27個孔。確保24孔板內(nèi)的細胞均勻分布后輕放于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至密度達80%～90%且狀態(tài)良好，按照Lipofectamine 2000轉染方法進行梯度轉染。每種細胞為1個單獨的試驗，分為3個組：空白組、空質粒組和重組質粒轉染組，空質粒組和重組質粒轉染組分別設定4個濃度梯度，DNA(μg)∶Lipofectamine 2000(μL)分別為1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0。每個單獨的試驗設定3個重復。

1.2.5 熒光蛋白表達情況的檢測及轉染效率的評價 細胞轉染48 h后觀察并拍攝24孔板中的各組細胞在熒光顯微鏡100倍視野下的圖像；轉換為200倍視野，記錄每孔隨機5個視野中細胞總數(shù)和帶有綠色熒光的細胞數(shù)，參照文獻[4]計算轉染效率。轉染效率/%=(帶有綠色熒光的細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.2.6 Western blot檢測目的蛋白的表達 收取4種細胞空質粒組和重組質粒轉染組中以DNA(μg)∶Lipofectamine 2000(μL)為1∶2.0的比例轉染48 h的細胞蛋白，以4∶1的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，100 ℃金屬浴煮10 min，冰浴冷卻后，進行SDS-PAGE和轉膜。以抗GFP的鼠單克隆抗體(1∶1 000稀釋)為一抗，以HRP標記的山羊抗小鼠IgG為二抗，進行Western blot檢測。

1.2.7 統(tǒng)計分析 試驗結果以“平均值±標準差”的方式表示。采用GraphPad Prism 7軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 真核重組熒光質粒pEGFP-N1-EtHP的構建 以E.tenella第2代裂殖子cDNA為模板，用含有SacI和SacⅡ酶切位點的特異性引物擴增后經(jīng)凝膠電泳分析，發(fā)現(xiàn)有與預期大小一致的目的條帶，約為450 bp(圖1A)。菌液PCR鑒定結果顯示，選取的4個單菌落均為陽性(圖1B)。測序結果分析顯示，EtHP基因插入到pEGFP-N1中，無移碼和突變。

圖1 Et HP基因和菌液的PCR擴增

2.2 熒光蛋白表達情況的檢測 去內(nèi)毒素提取的pEGFP-N1-EtHP轉染至DF-1細胞、Vero細胞、BHK細胞和HD-11細胞，其中質粒與Lipofectamine 2000的比例分為4個梯度：1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0。轉染48 h后在熒光顯微鏡下觀察到，重組質粒轉染組均出現(xiàn)綠色熒光(圖2F～2I)，空白組未出現(xiàn)綠色熒光(圖2E),表明真核重組熒光質粒均轉染至4種細胞內(nèi)并成功表達。

2.3 轉染率的評價 在同一種細胞中，隨著Lipofectamine 2000脂質體濃度增加，綠色熒光明顯增多，即轉染效率升高(圖2，表1)。在DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)比例相同的情況下，真核重組熒光質粒在DF-1細胞中的轉染效率均顯著高于其他3種細胞(P<0.05)；在 DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)比例為1∶2.0時，真核重組質粒在DF-1細胞中轉染效率最高(表1)。

2.4 Western blot檢測目的蛋白的表達 4種細胞蛋白Western blot檢測結果如圖3所示，重組質粒轉染組均在43.5 kDa處均有清晰的特異條帶，證明EtHP蛋白在4種細胞中均得到表達。

圖3 Western blot檢測

3 討論

本試驗采用DNA重組技術將EtHP基因插入pEGFP-N1載體后在不同細胞內(nèi)進行表達，通過直觀地觀察表達綠色熒光蛋白細胞數(shù)的多少來計算轉染效率，簡易地篩選出目的基因高效表達的細胞。

pEGFP-N1作為表達載體的優(yōu)點即可以通過倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達量來計算轉染效率，簡便、高效和可靠地檢測其轉染效果和表達情況[5-6]。細胞轉染技術作為分析基因產(chǎn)物或外源基因的功能的一個最重要工具[7]，被廣泛應用。本試驗采用目前常用的Lipofectamine 2000脂質體轉染的方式，操作較為簡便。在轉染過程中，化學試劑對細胞產(chǎn)生的毒性往往可以影響轉染效率[8]。Dass[9]研究表明，試劑與質粒的比例和細胞的類型不同均可產(chǎn)生不同的細胞毒性。因此，本試驗不僅將DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的比例分為4個梯度：1∶0.5、1∶1.0、1∶1.5和1∶2.0，而且選擇了4種不同的細胞：DF-1細胞、Vero細胞、BHK細胞和HD-11細胞。DF-1細胞[10-12]和HD-11細胞[13]是雞球蟲研究中最普遍使用的宿主細胞，BHK細胞[14]和Vero細胞[15]常被選為真核重組質粒蛋白表達細胞。本試驗結果表明，在一定程度上，脂質體濃度的增加可以提高轉染效率；脂質體濃度較低時，細胞毒性雖然較小但轉染效率極低；BHK細胞和HD-11細胞即使增加脂質體的濃度，轉染效率也未見很大幅度的提升，這與其他學者的研究結論不一致[16-17]，可能是由于細胞培養(yǎng)狀態(tài)、質粒的大小、培養(yǎng)基與血清的質量以及轉染混合液與細胞的接觸時間長短不同，因此轉染效率也有所不同。無論DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的比例為多少，DF-1細胞的轉染效率都較其他細胞高，Vero細胞其次；當DNA(μg)與Lipofectamine 2000(μL)的比例為1∶2.0時，DF-1細胞轉染效率顯著升高(P<0.05，表1)。同時綠色熒光的多少也更直觀的反映了轉染效率的高低(圖2)。因此，DF-1細胞可作為真核熒光重組質粒pEGFP-N1-EtHP的高效轉染細胞。

圖2 轉染后48 h綠色熒光蛋白表達情況(100×，標尺=10 μm)

表1 重組熒光質粒在不同細胞中的轉染效率

國內(nèi)有關同一外源基因轉入不同細胞轉染效率的研究報道尚少。本試驗通過簡單的轉染效率評價，篩選出了pEGFP-N1-Et HP的高效轉染細胞即DF-1細胞，為下一步Et HP蛋白在柔嫩艾美爾球蟲入侵細胞過程中作用的研究提供了試驗基礎。