管花肉蓯蓉醇提物抗小鼠運動性疲勞的效果

祖木熱提汗·買買提 ， 陳 卓 ， 馬義誠 ， 加依娜古麗·吐爾遜拜 ， 張曉紅 ， 趙紅瓊 ， 郝智慧 ， 姚 剛

(1. 新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 新疆 烏魯木齊 830052 ； 2. 中國農業(yè)大學動物醫(yī)學院 ， 北京 海淀 100193)

運動性疲勞(Exercise fatigue or exercise-induced fatigue)是由運動引起的肌肉最大收縮或者最大輸出功率暫時性下降以及機體多方面生理功能的復雜變化過程[1]。采用動物模型研究運動性疲勞能夠更加客觀反映出機體的生理生化變化機理，有利于評價機體的損傷變化[2]。Bedford等[3]1979年設計了一種基于耗氧量變化的大鼠10階段有氧跑臺運動狀況測定程序和相應的測定裝置。運動過程中心率(Heart rate,HR)、血壓(Blood pressure,BP)、血尿素氮(Blood urea nitrogen,UREA)、血糖(Blood glucose,GLU)、乳酸(Lactose,LAC)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、肌酸激酶(Creatine kinase,CK)、乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)、肝糖原(Hepatic glycogen,HG)和肌糖原(Muscle glycogen,MG)等指標的變化常作為運動性疲勞產生的生物醫(yī)學指征[4-6]。朱浩[7]采用大鼠跑臺運動方法建立運動性疲勞模型，發(fā)現力竭大鼠CK、LAC和UREA顯著上升，LDH、MG和HG含量顯著下降。殷娟娟[8]研究證明，小鼠力竭運動后骨骼肌Bcl-2/Bax的蛋白比值顯著降低。管花肉蓯蓉[Cistanchetubulosa(Schenk) Wight,CtW]屬列當科(Orobanchaceae)肉蓯蓉屬(Cistanche)多年寄生性草本植物，又名蓯蓉、大蕓等。主要分布于我國內蒙古、青海、陜西、甘肅、寧夏、新疆南部地區(qū)以及國外一些地區(qū)[9-10]。管花肉蓯蓉化學成分主要包括苷類、萜類、生物堿類、糖類、微量元素和氨基酸等[11]，其中苯乙醇苷類具有抗氧化、抗病毒、增強免疫力、改善記憶力、抗衰老等多種藥理作用[12]。丁瓊[13]采用游泳運動小鼠模型測定了景天三七提取物灌胃后小鼠抗疲勞作用，發(fā)現景天三七提取物可發(fā)揮顯著抗疲勞作用。管花肉蓯蓉與景天三七具有相似的化學組成，但管花肉蓯蓉提取物是否也具有抗運動性疲勞效果尚未見報道。因此，本試驗擬采用小鼠跑臺運動方法制備運動性疲勞小鼠模型，進行管花肉蓯蓉醇提物抗小鼠運動性疲勞的研究，以期為管花肉蓯蓉抗疲勞制劑的研發(fā)奠定試驗動物藥效學基礎。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑 管花肉蓯蓉，購自新疆和田地區(qū)于田縣中醫(yī)藥店；大孔樹脂，購自北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇，購自天津永晟精細化工有限公司；肝糖原、肌糖原測定試劑盒，均購自南京建成生物研究所；乳酸(LAC)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、尿素氮(UREA)、血糖(GLU)生化試劑片，均購自美國愛德士有限公司。

1.2 儀器 中藥粉粹機，浙江省溫嶺市大鵬機械有限公司產品；旋轉蒸發(fā)皿，上海亞榮生化儀器廠產品；動物跑步機，城都泰盟軟件有限公司產品；紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產品；血液生化分析儀，北京益仁恒業(yè)科技有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 實驗動物 4～5周齡雄性健康昆明小鼠60只，體重為18～22 g，購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心 [生產許可證號：SCXK(新)2018—0001，使用許可證號：SYXK(新)2018—0003]。小鼠每天飼喂商品顆粒飼料(購自新疆醫(yī)科大學實驗動物中心)1次，自由采食和飲水(凈化水)。實驗室飼養(yǎng)環(huán)境安靜、清潔，光照、通風良好，無異味。墊料定期更換，保持干燥。飼養(yǎng)環(huán)境及動物試驗已經通過新疆農業(yè)大學實驗動物福利倫理委員會審核批準(批準號為2019015)。

1.3.2 管花肉蓯蓉醇提物的制備 采用中藥粉碎機(轉速2 800次/min)將管花肉蓯蓉粉碎呈粉狀。參照任璐等[14]的提取方法，精確稱取500 g管花肉蓯蓉粉，加入75%的乙醇溶液5 L(1∶10)浸泡24 h。12層紗布過濾棄藥渣，利用大孔樹脂過濾。濾液通過旋轉蒸發(fā)儀濃縮至500 mL得到液體狀醇提物(每毫升含生藥1 g)。

1.3.3 小鼠適應性運動訓練與試驗分組 采用動物跑步機參照劉曉莉等[15]的方法設計訓練計劃(表1)，坡度為0°，轉速為10 m/min和 14 m/min，運動訓練時間為15 min，每天1次，經3 d適應性訓練，隨機分為5個組：不運動組(Non exercise control,NE)、運動組(Exercise control,EC)，每組10只；管花肉蓯蓉醇提物低劑量組(E+CtW-L)、中劑量組(E+CtW-I)和高劑量組(E+CtW-H)，每組12只。具體處理方法如表2所示。

表1 小鼠跑步機適應性訓練計劃

表2 管花肉蓯蓉醇提物灌胃小鼠劑量分組與處理

1.3.4 小鼠運動跑臺運動性疲勞模型的建立 經過適應性訓練的小鼠，參照Bedford等[3]方法采用小鼠跑步機設計10階段運動性疲勞訓練計劃(表3)，制備小鼠運動性疲勞模型。主要觀測運動時后肢蹬地力量、腹部與跑道的接觸程度、維持運動強度能力、對刺激的應答反應能力和力竭狀態(tài)的出現等。

表3 10階段運動訓練參數

1.3.5 指標測定 (1)體重測定：每天小鼠灌胃之前使用電子天平測量小鼠體重并記錄。(2)器官相對重量測定：試驗結束處死小鼠，采集心、肝、脾、肺、腎、胃和腸等器官測定濕重，按公式：器官相對重量/%=器官濕重/小鼠體重×100%，計算器官相對重量。(3)運動性疲勞相關指標測定：采用愛德士全自動生化分析儀測定血清GLU、LAC、UREA、 LDH、CK含量，MG、HG含量按試劑盒說明書操作測定。(4)肺組織顯微結構觀察：采集運動前和運動后小鼠肺臟，用10%甲醛固定，H.E.染色，制作石蠟組織切片于光學顯微鏡下觀察。

1.3.6 管花肉蓯蓉醇提物抗小鼠運動性疲勞效果測定 (1)給藥方式：管花肉蓯蓉醇提物根據實驗動物學、中藥藥理學教材[16-17]藥物4倍稀釋法，計算低、中、高劑量的濃度。灌胃劑量為0.2 mL/(10 g·bw)，每天早晨10:30對CtW各劑量組小鼠灌胃1次，連續(xù)灌胃14 d。 EC組灌胃等體積的生理鹽水。灌胃結束后開始補飼料，試驗期間各組小鼠的飼養(yǎng)條件一致。具體分組和試驗處理見表2。(2)運動方式：同表3。以實驗動物疲勞模型所獲的疲勞階段為依據，CtW低、中、高劑量組的50%動物終止運動，其余的50%動物繼續(xù)運動至力竭狀態(tài)后再進行上述指標測定。

1.4 統(tǒng)計學方法 各項運動相關指標和血清生理生化測定數據均用平均數±標準誤(Mean±SE)表示，器官相對重量以百分比表示。利用GraphPad Prism 8軟件進行統(tǒng)計學分析。NE組與EC組之間進行非配對t檢驗，管花肉蓯蓉醇提物各劑量組與EC組之間進行單因素方差分析(One-way ANOWA)。P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。

2 結果

2.1 小鼠運動性疲勞模型建立

2.1.1 小鼠運動性疲勞體征變化 當小鼠運動至第9階段，坡度為10°，跑臺轉速為20 m/min時，小鼠出現拒絕跑步，腹部和跑臺密切接觸，電刺激數增加到2.8 c/phase，小鼠反應遲鈍，仍滯留在電磁感應區(qū)，此階段初步視為出現疲勞癥狀(圖1)。

圖1 小鼠運動至疲勞狀態(tài)電刺激次數變化

2.1.2 運動性疲勞對小鼠體重和器官相對重量的影響 結果如圖2所示，EC組小鼠體重[(29.15±0.64)g]與NE組小鼠體重[(32.39±1.39)g]相比顯著下降(P<0.05)。EC組肝臟相對重量(4.63%±0.09%)和腎臟相對重量(1.11%±0.18%)均比NE 組(5.28%±0.23%和1.59%±0.62%)顯著降低(P<0.05)。而其他所測定的器官相對重量變化差異不顯著(P>0.05)。

圖2 不運動組和運動組小鼠體重、器官相對重量比較

2.1.3 運動性疲勞對小鼠血清生化指標及肌糖原和肝糖原含量的影響 結果如圖3所示，第9階段EC組小鼠GLU [(2.80±0.47)mmol/L]、LDH[(1 373 ±85.83)U/L]、MG[(1.80±0.11)mg/g]和HG[(6.92±0.21) mg/g]含量均極顯著低于NE組[GLU：(8.73±1.07) mmol/L，LDH：(2 709±87.51)U/L，MG：(4.05±0.24) mg/g, HG：(24.65±2.42) mg/g](P<0.01)。而EC組的UREA[(15.71±1.69) mmol/L]和CK[(739.3±2.31)U/L]含量均極顯著高于NE組[(6.70±0.54)mmol/L和(337.8±0.41)U/L](P<0.01)。EC組小鼠LAC含量與NE組相比也呈升高趨勢(P=0.099)。

圖3 運動性疲勞對小鼠血清生化指標及MG、HG含量的影響

2.1.4 運動性疲勞對肺組織形態(tài)學影響 與NE組小鼠相比，EC組小鼠局部肺泡擴張，肺泡壁斷裂，肺泡相互融合(圖4B 1)，肺泡間質增寬(圖4B 2)，肺間質內可見淋巴細胞浸潤(圖4B 3)，但肺泡內未有炎性滲出。

圖4 肺臟組織切片圖(H.E.染色，40×)

2.2 管花肉蓯蓉抗小鼠運動性疲勞的效果

2.2.1 管花肉蓯蓉對第9階段運動小鼠器官相對重量的影響 結果如表4所示，各CtW組與EC組相比，體重無差異(P>0.05)。與運動組相比，E+CtW-I組小鼠肺臟和腎臟器官相對重量均顯著增加(P<0.05)，其他臟器無顯著變化(P>0.05)。

表4 第9階段管花肉蓯蓉對小鼠臟器器官相對重量的影響

2.2.2 管花肉蓯蓉對第9階段運動小鼠運動參數及運動性疲勞相關指標的影響 由封三圖5可知，各CtW組與EC組相比，運動時間、運動歷程和刺激次數等參數無顯著差異(P>0.05)。由封三圖6可知，與NE組相比，EC組小鼠的GLU、MG和HG含量極顯著降低(P<0.001)，LDH含量也呈現顯著下降趨勢(P=0.054)，而UREA含量極顯著升高(P<0.001)，CK含量也呈顯著上升趨勢(P=0.068)，LAC含量無差異(P>0.05)。整體顯示，第9階段EC組大鼠出現疲勞狀態(tài)。而各CtW組與EC組相比，E+CtW-L組GLU含量極顯著高于EC組(P<0.001)，UREA含量顯著低于EC組(P<0.05)，CK含量也呈顯著下降趨勢(P=0.052)。 各CtW組的LDH均極顯著高于EC組(P<0.01)，E+CtW-I組和E+CtW-H組的MG含量極顯著高于EC組(P<0.001)，而E+CtW-L組和E+CtW-I組的HG含量也顯著高于EC組(P<0.05)。結果表明各CtW組小鼠尚未出現運動性疲勞狀態(tài)。

2.2.3 管花肉蓯蓉對第10階段運動小鼠臟器相對重量的影響 由表5可知，在第10階段各CtW組與EC組相比，器官相對重量無顯著變化(P>0.05)。

表5 第10階段管花肉蓯蓉對小鼠臟器器官相對重量的影響

2.2.4 管花肉蓯蓉對第10階段運動小鼠運動參數及運動性疲勞相關指標的影響 由封三圖7可知，與EC組相比，E+CtW-L組的運動時間和距離顯著延長(P<0.05)，而E+CtW-I組和E+CtW-H組的運動時間和距離極顯著延長(P<0.01)。各CtW組電刺激次數與EC組相比，差異不顯著(P>0.05)。由圖8可知，各CtW組的GLU含量與EC組相比無顯著差異，但均極顯著低于NE組(P<0.01)。E+CtW-H組的UREA含量與EC組比較無顯著差異(P>0.05)，但E+CtW-L組和E+CtW-I組的UREA含量顯著低于EC組(P<0.05)。E+CtW-H組的LAC含量顯著低于EC組(P<0.05)。各CtW組的LDH含量均顯著高于EC組(P<0.01)，各CtW組的CK含量均顯著低于EC組(P<0.05)，E+CtW-I組的MG和HG含量也極顯著高于EC組(P<0.01)。

圖8 第10階段小鼠運動性疲勞相關指標

3 討論

3.1 小鼠運動性疲勞模型的建立 運動性疲勞模型大多以大鼠或小鼠作為試驗對象，采用跑臺上運動、游泳運動建立[18]。本試驗采用Bedford等[3]建立的經典10階段運動方案。參照楊堤[19]研究的UREA、 LAC、CK、LDH以及MG、HG等疲勞指標進行評價。本試驗結果顯示，EC組UREA和CK含量極顯著高于NE組，而GLU、LDH、MG和HG含量極顯著低于NE組，這些結果與Takeda等[20]的研究結果一致。觀察力竭小鼠肺泡，結果發(fā)現EC組出現局部肺組織肺泡擴張、肺泡塌陷。與張童君[21]建立的疲勞模型中大鼠肺臟形態(tài)變化的研究結果一致。證明本試驗的10階段運動性疲勞模型建立成功。

3.2 管花肉蓯蓉抗運動性疲勞效果 尋找更加安全有效的抗疲勞物質己經成為全球研究熱點。本試驗結果顯示，連續(xù)灌胃管花肉蓯蓉醇提物14 d，各劑量小鼠日常生活行為無任何異常，但E+CtW-I組肺臟和腎臟器官相對重量顯著增加，其他臟器無顯著變化。這個現象可能提示管花肉蓯蓉醇提物對肺臟和腎臟沒有保護功能。覃茂鑫等[22]研究顯示，給小鼠注射大蒜素可極顯著提高游泳時間，降低CK、UREA和LAC水平。此研究結果與本試驗結果一致，說明管花肉蓯蓉醇提物可降低血清CK、UREA和LAC的含量，補充體內所需要的營養(yǎng)和能源物質，具有抗運動性疲勞的作用。

3.3 管花肉蓯蓉延緩運動性疲勞效果 運動時間延長是抗運動性疲勞的直觀外在體現，因此用力竭時間的長短作為本試驗的一個指標。鄭尚莉[23]研究給小鼠灌胃藍莓濃縮汁，發(fā)現其可顯著延長小鼠力竭游泳時間。張磊[24]研究發(fā)現，給小鼠灌胃楓糖可延緩小鼠負重游泳時間，降低血清CK和UREA含量，顯著升高MG、HG和LDH含量。本試驗使用管花肉蓯蓉醇提物對小鼠灌胃，明顯延長了小鼠在一定運動強度下持續(xù)運動時間和運動歷程，并降低了CK和UREA含量，增加了HG、MG和LDH含量，該結果與上述研究結果基本一致。綜上，管花肉蓯蓉醇提物能夠延緩小鼠運動性疲勞的發(fā)生，具有抗小鼠運動性疲勞、提高運動耐力、延緩力竭狀態(tài)出現的作用。