天然藥物抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的研究進展

葉 泥 ， 顏其貴 ， 王 彬

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.四川農業大學動物醫學院 ， 四川 成都 611130)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱“豬藍耳病”，主要臨床表現為發熱、呼吸困難、耳部皮膚發紺、厭食，懷孕母豬發生流產、產死胎、弱仔、木乃伊胎等。根據基因序列的差異，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)可以分為2個基因型：歐洲Ⅰ型和北美Ⅱ型，兩者同源性在60%左右，我國流行株主要屬于北美Ⅱ型。目前，我國在防控該病過程中主要以疫苗預防為主，藥物治療效果往往不佳。中藥作為天然藥物的代表，在治療新型冠狀肺炎中療效十分顯著，充分顯示天然藥物在抗病毒中的巨大潛力。天然藥物具有藥效不易喪失、耐藥性產生較少、副作用較小等特點，部分天然藥物還有提高機體免疫力的優點，其抗病毒作用不僅體現在直接作用于病毒上，還能增強機體免疫力，保護機體免受病毒損害。中藥在我國有悠久的歷史，經歷此次新冠疫情后，天然藥物研究受到了極大的重視，在天然藥物抗PRRSV的研究中，以體外細胞試驗和豬日糧中添加藥物試驗為主，目前選用的細胞主要是非洲綠源猴腎細胞(Marc-145細胞)和豬肺泡巨噬細胞(3D4/2細胞)，本文對部分抗PRRSV天然藥物的研究進行了整理，希望能為尋找抗PRRSV的新型獸藥提供參考。

1 天然藥物在Marc-145細胞上抵抗PRRSV感染的作用

1.1 葛根連芩提取液抗PRRSV的作用 葛根芩連湯最早出自《傷寒論》，是經典古方之一，主要成分是葛根、甘草、黃芩和黃連，原主治邪熱下痢，在現代醫學應用中已遠超原方之治。在治療細菌性痢疾[1]、輪狀病毒感染[2]、糖尿病等[3]方面都有良好的效果，此外，通過網絡藥理學分析提示該方對治療新型冠狀肺炎也有一定效果[4]。汪志等[5]在Marc-145細胞上研究葛根連芩提取液抗PRRSV的作用，結果發現葛根連芩提取液1∶250和1∶500倍稀釋時，對PRSSV的阻斷作用明顯，但所有設置的稀釋倍數對PRRSV的抑制作用不理想，推測該藥通過與細胞膜作用，減弱病毒與受體的結合能力，增強了細胞對PRRSV的抗感染能力。單獨使用葛根芩連湯的部分成分提取物對抗PRRSV依然具有效果，曾強等[6]研究甘草粗提物對PRRSV 突變株(PRRSV PX)感染Marc-145細胞的作用中發現，在最大安全質量濃度下，甘草粗提物能阻斷、抑制和直接殺滅PRRSV PX(質量濃度分別為3.125、0.319 g/L和0.782 g/L)，同時對Marc-145細胞分裂增殖有促進效果，且最佳質量濃度與試驗中板藍根和魚腥草粗提物濃度一致，都為1.563 g/L，這可能與提取物中的未知生長調節因子有關。甘草酸是甘草的主要作用成分之一，胡安君等[7]在體外用Marc-145細胞研究發現，甘草酸阻斷PRRSV感染是通過減少PRRSV GP4的表達，降低細胞CD163和CD151受體的表達來實現的。CD163是PRRSV感染的主要受體，介導病毒內化和宿主細胞中病毒核酸的釋放，能與PRRSV的重要包膜蛋白GP4在脂筏內相互作用[8]，介導病毒入侵細胞。冼瓊珍等[9]研究發現，黃連、黃芩水提物對Marc-145細胞的最大安全濃度均為1.56 mg/mL，2種藥物對PRRSV的抑制作用最顯著，直接殺滅作用次之，阻斷作用相對較弱。藥物抑制作用(先加病毒后加中藥)的機理可能是病毒先入侵了細胞并產生破壞，后加入的中藥干擾了細胞內病毒的復制，抑制病毒增殖和釋放；直接殺滅作用(中藥與病毒同時加入)則同中藥的生物活性成分與病毒直接結合破壞病毒結構或與藥物干擾病毒RNA和蛋白質的合成有關；阻斷作用(先加中藥后加病毒)中細胞先與藥物作用，可能是藥物中的多糖、黃酮類等活性成分增強了細胞膜的穩定性，使細胞避免了受病毒的吸附而得到保護，提高了細胞抗病毒感染的能力。

1.2 龍膽草、苦參堿抗PRRSV的作用 中藥成分復雜，需明確中藥發揮作用的有效成分，才能更好的發展和利用中藥。為探究龍膽草總苷、龍膽草總黃酮及龍膽草水提物在體外抗PRRSV的作用，以Marc-145細胞為體外模型，利巴韋林為陽性對照，發現龍膽草總苷、龍膽草總黃酮及龍膽草水提物對病毒的阻斷、抑制和直接殺滅作用分別為33.4%、78.2%、81.9%；66.1%、41.1%、42.7%；43.1%、57.4%、56.4%，龍膽草總苷的抑制和直接殺滅作用高于龍膽草總黃酮、龍膽草水提物和陽性對照利巴韋林。綜合阻斷、抑制和直接殺滅作用的結果，龍膽草總苷抗PRRSV效果較佳，其次是龍膽草水提物和龍膽草總黃酮[10]。秦楓等[11]運用同樣的研究方式得出半邊蓮水提物、半邊蓮總黃酮和半邊蓮總生物堿都具有體外抗PRRSV的作用，其中，半邊蓮總黃酮抗PRRSV的效果最好，半邊蓮水提物的效果最差。苦參是我國傳統藥物之一，其主要活性成分為苦參堿，苦參堿具有抗炎、抗皮膚纖維化、抗免疫抑制等作用，氧化苦參堿能改變細胞受體和干擾細胞內核酸的合成[12]。趙昕等[13]用Marc-145細胞于體外研究苦參堿對PRRSV的復制抑制、阻斷吸附和直接殺滅作用時，發現苦參堿的最大安全濃度為750 mg/L，在安全濃度范圍內對PRRSV感染Marc-145細胞的抑制率達到93.6%，直接殺滅作用的最高抑制率大于95%，表明苦參堿在體外有抗PRRSV的作用和對PRRSV有直接殺滅作用，但不能阻斷PRRSV對Marc-145細胞的吸附。孫盼盼等[14-15]對苦參堿抗PRRSV的機制進行了探索，發現在PRRSV感染Marc-145細胞24 h內，苦參堿能顯著降低該病毒N基因的表達，并且在病毒感染Marc-145細胞的不同時間通過抑制不同細胞受體的表達來抑制PRRSV吸附和入侵宿主細胞，從而持續性抑制PRRSV在細胞中的復制，此外，還發現苦參堿不是通過抑制ERK1/2信號通路的激活來發揮抗PRRSV作用的。在研究不同苦參堿和甘草酸組方對PRRSV的作用時發現，兩者按質量比1∶4，組方藥物質量濃度為0.25 mg/mL時，效果最好且使用最安全，增殖抑制和直接殺滅PRRSV的Marc-145細胞病變抑制率分別為76.95%和83.25%[16]。此外，人參多糖、牛蒡苷元、辣蓼黃酮正丁醇在體外Marc-145細胞中對PRRSV都有一定的阻斷、抑制和直接殺滅作用。

1.3 板藍根、黃芪抗PRRSV的作用 板藍根具有清熱解毒、涼血消腫的功效，板藍根多糖是其主要作用成分，具有抗病毒和促進免疫等功能。早年的研究證實，板藍根對PRRSV有明顯的阻斷和抑制作用。王學兵等[17]用水煮醇沉法提取板藍根多糖，觀察其在體外對PRRSV的作用效果，發現阻斷和抑制效果較好，最小阻斷濃度為2.094 μg/mL，最小抑制濃度為8.375 μg/mL。梅春升[18]在Marc-145細胞上綜合評判了12種中藥的安全濃度及與豬γ干擾素聯合用藥抗PRRSV的效果，結果顯示黃芪、黃芩和板藍根的治療指數位于前三，且它們分別與重組的豬γ干擾素聯合用藥時具有明顯的協同作用。劉櫻等[19]的研究發現，黃芪及其提取物具有較強的抗PRRSV的作用，研究板藍根、黃芪和青蒿及其提取物體外抗PRRSV作用時發現，在最大安全濃度的基礎上，3種中藥單方中黃芪的阻斷作用和直接殺滅作用最強，都能達到100%的保護率；中藥提取物中板藍根多糖對PRRSV的阻斷作用最強，青蒿素最差，抑制試驗中三者作用相當，但板藍根多糖對病毒不具有直接殺滅作用，綜合3種作用方式得出，3種中藥單方中黃芪效果最好，青蒿最差，提取物中黃芪多糖抗PRRSV作用最好，板藍根多糖最差。

2 天然藥物在3D4/2細胞上抵抗PRRSV感染的作用

目前認為，PRRSV感染的原發性靶細胞是豬肺部巨噬細胞，巨噬細胞通過直接吞噬和分泌淋巴因子而在非特異性免疫中起著十分重要的作用，PRRSV感染后機體會出現免疫抑制，有利于病毒在宿主體內的傳播，且在豬中能發生持續性感染。梁亞俊[20]從金銀花、連翹和板藍根中分別提取有效成分綠原酸、連翹酯苷A和表告依春，研究以上有效成分對PRRSV感染3D4/2細胞的抑制效果，綠原酸、連翹酯苷A和表告依春的最大安全濃度分別為250、125 μg/mL和1 000 μg/mL，在最大安全濃度下都能增加3D4/2細胞TNF-α和IL-6的分泌并抑制IL-10的分泌；綠原酸和連翹酯苷A還能增強細胞的吞噬能力[20]。宿主在感染PRRSV后，具有抗病毒活性的TNF-α的表達被PRRSV抑制[21]，IL-6具有多種免疫調節作用和干擾素樣活性，能抑制病毒和抗腫瘤，PRRSV感染的病豬外周血液中的IL-6表達水平會增加[22]，IL-10能抑制巨噬細胞分泌促炎性細胞因子，造成PRRSV復制和持續感染[23]。加入綠原酸、連翹酯苷A和表告依春后，以上細胞因子表達量都向有利于細胞存活方向發生了改變，增強了細胞的非特異性免疫，此外，綠原酸、連翹酯苷A和表告依春還具有直接滅活PRRSV和抑制PRRSV引起的細胞凋亡的作用[20]。

3 天然藥物抗PRRSV的豬體內試驗

1996年，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所首次從國內的疑似豬繁殖與呼吸綜合征病例中分離出PRRSV。2006年，我國暴發了大范圍的高致病性藍耳病，養豬業損傷嚴重。目前，仍沒有針對該病的特效藥，天然藥物抗PRRSV和提高宿主免疫力的研究中已有部分進入豬體內試驗階段。吳小萍等[21]用PRRSV攻毒健康仔豬后，用姜黃素拌料飼喂仔豬，發現姜黃素不能降低PRRSV感染引起的溫度升高，也不能誘導抗PRRSV特異性抗體的顯著升高，但能誘導特異性淋巴細胞增殖，攻毒21 d后可顯著降低病毒血癥水平，顯示姜黃素對抑制仔豬體內的PRRSV有一定的作用，也有體外試驗證實姜黃素是通過誘導血紅素加氧酶-1的表達來抑制PRRSV復制的[22]。王惠[23]使用PRRSV弱毒苗免疫后備母豬后，飼喂板藍根顆粒、板藍根顆粒配合黃芪多糖、板青顆粒配合黃芪多糖，研究其對免疫抗體的影響，30 d后檢測血液發現，板藍根顆粒配合黃芪多糖作為免疫調節劑效果明顯，能穩定抗體水平，降低散毒風險；板藍根顆粒、板藍根顆粒配合黃芪多糖能有效降低血液中PRRSV的核酸載量。多個天然藥物的提取成分對豬繁殖與呼吸綜合征疫苗有免疫增強作用，如板藍根多糖、黃芪多糖、白花蛇舌草多糖、山藥多糖和馬尾藻多糖。嚴安毓[24]將黃芪多糖、銀黃可溶性粉和板藍根顆粒科學配伍后添加于飼料中給各階段豬食用，發現其可明顯降低仔豬血液、母豬臍帶血和公豬精液中的帶毒率，降低仔豬發病率及促進保育仔豬生長和發育。劉洋[25]、田春雷[26]、袁威[27]在對復方中藥“豬康散”(主要成分為金銀花、連翹、板藍根、黃連、黃芪、黃柏、大黃、白芍、石膏、知母、梔子、甘草)的研究中發現，其在人工感染PRRSV的仔豬體內抗PRRSV的作用表現在如下方面：促進淋巴細胞增殖，減少凋亡，提高機體細胞免疫能力；提高血清和組織抗氧化功能，以清除自由基、改善機體功能，提高抗PRRSV的能力；明顯提高血清中免疫球蛋白和細胞因子水平，增強機體特異性免疫功能，而達到抗PRRSV的作用。除豬體內試驗外，蔡丙嚴等[28]通過給SD大鼠飼喂野大黃，分離其含藥血清，用于研究含藥血清在體外對PRRSV的抑制作用發現，含野大黃的血清有抑制和直接殺滅PRRSV的功效。

近些年，通過體外和體內研究中藥/復方/中獸藥制劑對PRRSV作用的研究較多，如冼瓊珍等[9,29]先后研究了26種中藥對PRRSV的阻斷、抑制、直接殺滅作用，表1中整理了部分抗PRRSV的藥物。

表1 抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的有效中藥/復方/中獸藥制劑

4 展望

我國天然藥物資源豐富，同時也是中藥的發源國，可作為抗病原微生物天然藥物的篩選庫，在許多著作中都有應用天然藥物預防和治療人和動物疾病的記錄。在探索天然藥物治療豬繁殖與呼吸綜合征的過程中，雖然已經發現多種藥物有抗PRRSV和提升機體免疫力的作用，但中藥的成分復雜，有效成分、抗PRRSV機制、配伍禁忌、最佳劑量等資料尚不全面，皆可作為今后研究的方向。