刺五加多糖納米乳對免疫抑制小鼠的免疫增強作用

李向輝 ， 黃 慧 ， 周延州 ， 閆盼盼 ， 李清苗 ， 黃蓮菊 ， 馬 霞

(河南牧業經濟學院動物醫藥學院 ， 河南 鄭州 450046)

刺五加多糖(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide，ASPS)是從五加科植物刺五加中提取出來的具有藥效活性的成分[1]。它可以激活并促進免疫細胞的產生，增強機體的免疫活性[2-4]。袁學千等[5]研究發現，刺五加多糖可明顯提高正常小鼠的脾臟和胸腺指數，促進腸系膜細胞增多，恢復免疫抑制小鼠的免疫功能；張英楠[6]研究發現，刺五加多糖對雞具有一定的免疫調節作用，能促進脾臟、胸腺的發育和巨噬細胞細胞數目的增多。目前，關于刺五加多糖的制劑很少，未見有關刺五加多糖納米乳(Acanthopanaxsenticosuspolysaccharide-nanoemulsion，ASPS-NE)對免疫抑制小鼠方面的研究。本試驗在前期制備刺五加多糖納米乳的基礎上[7]，利用環磷酰胺建立小鼠免疫抑制模型，通過對其胸腺、脾臟指數測定、脾細胞增殖活性檢測、碳廓清試驗、NK細胞活性檢測等來研究刺五加多糖納米乳對免疫抑制小鼠的免疫增強效果，從而為獸醫臨床提供一種新型有效的免疫增強劑，也為利用納米技術開發中藥免疫增強劑提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與藥品 刺五加多糖，購自西安小草植物科技有限公司(產地遼寧沈陽，多糖含量95%)；環磷酰胺(Cyclophosphamide，CTX)，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；小鼠淋巴細胞分離液，購自深圳市達科為生物股份有限公司；RPMI-1640培養液，購自北京索萊寶科技有限公司；10%胎牛血清，購自上海碧云天生物技術有限公司；刀豆球蛋白A(Concanavalin A,ConA)和脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)，均購自美國Sigma公司；CCK-8，購自日本東仁化學科技公司；印度墨汁，購自北京恒奧德科技有限公司；刺五加多糖納米乳(ASPS-NE)、空白納米乳、刺五加多糖水溶液(ASPS)，均由河南牧業經濟學院動物醫藥學院藥理學實驗室制備。

1.2 主要儀器 倒置生物顯微鏡，日本奧林巴斯公司產品；CO2培養箱，上海躍進醫療器械有限公司產品；多功能酶標儀，美國賽默飛世爾公司產品；紫外分光光度計，上海儀田精密儀器公司產品；臺式高速離心機，德國艾本德公司產品；超凈工作臺，鄭州生元儀器有限公司產品；恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司產品。

1.3 實驗動物與細胞 SPF級BALB/c小鼠，雌雄各半，6～8周 齡，體重(18±2)g，購自鄭州大學實驗動物中心[實驗動物質量合格證號：SCXK (豫)2020—0052]，小鼠自由采食和飲水，飼養溫度：(25±1) ℃、 相對濕度：40%±10%、光周期控制：12 h光-暗循環。YAC-1細胞，購自中國科學院上海細胞庫。

1.4 試驗方法

1.4.1 試驗設計 將70只BALB/c小鼠隨機分成7個組，每組10只，分別為ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組、ASPS-NE低劑量組、空白納米乳組、CTX模型組和正常對照組。ASPS水溶液組以50 mg/(kg·bw)的劑量皮下注射ASPS水溶液；ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組和ASPS-NE低劑量組分別以100、50 mg/(kg·bw)和25 mg/(kg·bw)的藥物劑量皮下注射ASPS-NE；正常對照組以0.1 mL/(10 g·bw)體重皮下注射生理鹽水；空白納米乳組以50 mg/(kg·bw)的用量皮下注射空白納米乳,每日1次，連用7 d。

另外，除正常對照組外，其余各組在第1、2天和第5天均按照80 mg/(kg·bw·d)的劑量皮下注射環磷酰胺，共3次，末次給藥24 h后將小鼠采用安樂死的方法致死后采集脾臟、胸腺等器官，收集脾細胞進行脾細胞增殖活性檢測，在動物試驗過程中嚴格遵守動物福利倫理的相關要求，減少對動物的應激和痛苦，采用對動物痛苦最少的方式進行處置。

1.4.2 免疫器官指數的測定 末次給藥12 h后，取每組小鼠并稱重，做好記錄，將小鼠脫頸處死，取出每只小鼠的脾臟和胸腺，分別稱重記錄，最后按照公式(1)計算每組的脾臟指數和胸腺指數。

公式(1)

1.4.3 脾細胞增殖活性檢測 末次給藥12 h后，無菌采集小鼠脾臟進行研磨，用小鼠淋巴細胞分離液收集脾細胞，制成密度為5×105個/mL的脾細胞懸液。按照分組情況，在96孔板中先加入脾細胞懸液，每孔100 μL，再分別加入含ConA(終濃度為5 μg/mL) 或者LPS(終濃度為10 μg/mL)的RPMI-1640培養液，每孔100 μL。同時設立只加入200 μL RPMI-1640培養液的空白對照組。在37 ℃、5% CO2培養箱中培養44 h后，向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度(OD值)，每個試驗重復4次。

1.4.4 單核巨噬細胞的吞噬活性檢測 參考文獻[8] 方法進行碳廓清試驗檢測。末次給藥12 h后，在小鼠尾靜脈注射印度墨汁(以生理鹽水按1∶5稀釋)0.2 mL，注射完之后馬上開始計時，分別在注射后的第2分鐘(t1)和第10分鐘(t2)進行眼眶采血，并將采集的血液(20 μL)加到2 mL 0.1% 的Na2CO3溶液中，搖勻，以此作為空白對照，用分光光度計測定波長600 nm處的吸光度OD值。處死小鼠后取出肝臟和脾臟，處理干凈后進行稱重，按公式(2)計算吞噬指數(α)。

公式(2)

其中，A1和A2分別為t1和t2時的吸光度OD值。

1.4.5 自然殺傷(NK)細胞活性檢測 無菌條件下取出復蘇好的YAC-1細胞，向其中加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液進行稀釋，制成密度為1×104個/mL 的YAC-1細胞懸液，作為靶細胞。效應細胞是制備的脾細胞懸液。試驗分為試驗孔、靶細胞對照孔、效應細胞對照孔和空白對照孔，試驗孔中加入脾細胞懸液和YAC-1細胞懸液各100 μL；靶細胞對照孔加入YAC-1細胞懸液和RPMI-1640培養液各100 μL；效應細胞對照孔加入脾細胞懸液和RPMI-1640培養液各100 μL；空白對照孔每孔只需加入200 μL 的RPMI-1640 培養液，重復3孔。然后將制備好的96孔板放在CO2培養箱中培養44 h后，取出向每孔加入10 μL CCK-8溶液，將培養板在培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定450 nm處的吸光度OD值。NK細胞活性通常用NK細胞殺傷率表示，按照公式(3)計算。

公式(3)

1.5 統計分析 試驗結果以“平均值±標準差”方式表示，采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，使用單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果

2.1 ASPS-NE對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響 結果如表1所示，與正常對照組相比，CTX模型組的脾臟和胸腺指數均極顯著減小(P<0.01)，說明環磷酰胺免疫抑制模型建模成功；與CTX模型組相比，空白納米乳組對免疫抑制小鼠的免疫器官指數影響不明顯(P>0.05)，而ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組、ASPS-NE低劑量組的脾臟指數和胸腺指數均極顯著提高(P<0.01)； 與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE高劑量組的脾臟指數和胸腺指數顯著提高(P<0.05),ASPS-NE中劑量組的指數極顯著提高(P<0.01)。

表1 ASPS-NE對免疫抑制小鼠免疫器官指數的影響

2.2 ASPS-NE對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響 結果如表2所示，與正常對照組相比，CTX模型組由ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖活性(OD值)均極顯著減小(P<0.01)，說明環磷酰胺免疫抑制模型建模成功；與 CTX模型組相比，ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組和ASPS-NE中劑量組由ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖活性(OD值)均極顯著增高(P<0.01)，而且ASPS-NE中劑量組由ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖的活性更強；與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE中劑量組由ConA和LPS誘導的脾淋巴細胞增殖活性增強效果極顯著(P<0.01)。結果表明，ASPS-NE高、中、低劑量組均能顯著增強免疫抑制小鼠脾淋巴細胞的增殖活性，尤其是ASPS-NE中劑量的效果更佳。

表2 ASPS-NE對免疫抑制小鼠脾淋巴細胞增殖活性的影響

2.3 ASPS-NE對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞系統的影響 結果如表3所示，與正常對照組相比，CTX模型組的吞噬指數極顯著降低(P<0.01)；與 CTX模型組相比，ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組和ASPS-NE低劑量組的吞噬指數極顯著增高(P<0.01)，ASPS水溶液組的吞噬指數顯著增高(P<0.05)；與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE中劑量組的吞噬指數極顯著增高(P<0.01)，ASPS-NE低劑量組的吞噬指數顯著增高(P<0.05)。結果表明，ASPS-NE高、中、低劑量組均能顯著增強免疫抑制小鼠單核吞噬細胞的指數，尤其是ASPS-NE中劑量的效果更佳。

表3 ASPS-NE對免疫抑制小鼠單核巨噬細胞系統的影響

2.4 ASPS-NE對免疫抑制小鼠脾臟NK細胞活性的影響 結果如表4所示，與正常對照組相比，CTX模型組、空白納米乳組的NK細胞殺傷率均極顯著降低(P<0.01)，說明小鼠免疫抑制劑模型造模成功；與CTX組模型相比，ASPS水溶液組、ASPS-NE高劑量組、ASPS-NE中劑量組和ASPS-NE低劑量組的NK細胞殺傷率均極顯著升高(P<0.01)，尤其是ASPS水溶液組、ASPS-NE中劑量組的NK細胞殺傷率升高更快，接近于正常對照組水平；與ASPS水溶液組相比，ASPS-NE中劑量組的NK細胞殺傷率極顯著升高(P<0.01)，其他組都呈降低水平。結果表明，ASPS-NE可以顯著增強免疫抑制小鼠的NK細胞活性，而且ASPS-NE中劑量的效果比ASPS水溶液更佳。

表4 ASPS-NE對免疫抑制小鼠NK細胞活性的影響

3 討論

脾臟和胸腺是機體發揮免疫作用的關鍵組織，常用其指數的高低來反映免疫器官發育的程度，脾臟和胸腺發育越好，質量越大，機體的免疫能力越強。環磷酰胺常用來建立免疫抑制動物模型，其會損害小鼠的肝臟，降低小鼠的脾臟和胸腺的免疫指數[9-10]。本試驗結果顯示，與正常對照組相比，CTX模型組的脾臟和胸腺的臟器指數明顯下降；相反，ASPS-NE高、中、低劑量組的臟器指數與CTX模型組相比有不同程度的明顯升高。單核-巨噬細胞系統具有免疫防御功能，能夠吞噬機體內異常的物質，清除對機體有害的物質。碳廓清試驗中，碳粒的清除速率能夠表明機體的吞噬能力[11]。本試驗結果顯示，ASPS-NE 能明顯增強免疫抑制小鼠的單核巨噬細胞吞噬指數，增強其吞噬能力，ASPS-NE 中劑量組的單核巨噬細胞的吞噬效果極顯著強于ASPS水溶液組。這些結果與翟旭楠等的研究結果相似，該研究小組采用CTX誘發免疫抑制模型來研究刺五加多糖對小鼠免疫功能的影響，發現 ASPS 用藥組的臟器指數與模型組相比顯著提高(P<0.05)，吞噬指數極顯著提高(P<0.01)[12]。以上結果表明 ASPS-NE與ASPS水溶液都能促進臟器指數升高，增強巨噬細胞的吞噬活性，ASPS-NE 的效果優于ASPS水溶液，尤其是中劑量ASPS-NE的效果更佳。因此，推斷ASPS-NE 可能通過激活巨噬細胞適應性免疫和先天免疫發揮作用。

脾臟是機體免疫系統的主要免疫器官之一，由 T 細胞和 B 細胞組成。脾淋巴細胞增殖是細胞免疫功能最直接的指標。可以通過探討ASPS-NE對脾淋巴細胞增殖的影響，研究其免疫增強作用。ConA、LPS分別可以刺激不同的淋巴細胞亞型，T 淋巴細胞對 ConA 敏感，B 淋巴細胞對 LPS 敏感[13]。因此，淋巴細胞增殖率是量化多糖免疫增強活性強弱的指標[14]。本試驗采用CCK-8法檢測脾細胞的增殖情況，在使用ConA和LPS作為誘導劑刺激脾細胞增殖過程中，發現與對照組相比，CTX 處理可以降低小鼠 T 淋巴細胞的增殖。經ASPS-NE處理后，淋巴細胞的增殖反應逐漸恢復到正常水平。ASPS-NE中劑量組脾細胞增殖效果最強，提示 ASPS-NE 通過抗原特異性促進脾細胞和淋巴細胞的增殖。這一結果與Li 等的研究結果相似，該研究小組發現淫羊藿多糖可以顯著促進 CTX 誘導的免疫抑制雞的淋巴細胞增殖，增強免疫應答[15]。此外有研究發現許多中藥多糖能夠逆轉 CTX 誘導的免疫抑制，增強機體的抵抗力[16]。

外周血、肝臟、脾臟是NK細胞常常存在的部位。NK細胞可以清除病變細胞，延緩細胞的衰老，極大的提高機體免疫力。當機體感染病毒以后，NK細胞發生活化，產生細胞毒性作用。NK細胞可以識別靶細胞，活化吞噬細胞，殺傷介質，從而增強機體的免疫能力[17-18]。本試驗發現ASPS-NE能夠提高NK細胞的殺傷率，即能夠增強NK細胞的免疫活性，而且ASPS-NE中劑量的效果比ASPS水溶液更佳。這同樣表明ASPS-NE可通過提高NK細胞的殺傷率，增強NK細胞的免疫活性來發揮免疫增強的效果。