不同濃度丙泊酚麻醉孕中期大鼠對(duì)雄性子代學(xué)習(xí)和記憶功能的影響及其機(jī)制▲

梅 靜 喇宏玲 徐桂萍

(新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院麻醉科,烏魯木齊市 830001，電子郵箱：my7future7@163.com)

人類(lèi)神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中接觸麻醉劑會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)變性和長(zhǎng)期神經(jīng)行為異常，例如學(xué)習(xí)障礙和記憶障礙等[1]。孕中期是神經(jīng)發(fā)生和神經(jīng)元遷移的時(shí)期，在此期間胎兒對(duì)外部環(huán)境十分敏感。而隨著腹腔鏡手術(shù)和胎兒手術(shù)的迅速發(fā)展，越來(lái)越多的孕婦在懷孕期間，特別是在孕中期進(jìn)行手術(shù)。因此，麻醉劑對(duì)胎兒出生前神經(jīng)發(fā)育的影響受到越來(lái)越多學(xué)者的關(guān)注。已有研究表明，丙泊酚可能對(duì)子代長(zhǎng)期行為產(chǎn)生影響，但其結(jié)論仍然存在很大的爭(zhēng)議[2-3]。因此，需要進(jìn)一步研究丙泊酚對(duì)孕中期胎兒神經(jīng)發(fā)育的影響及其機(jī)制。研究證實(shí)，鈣離子-鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶Ⅱ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ,CaMKⅡ)的磷酸化或激活，可激活環(huán)磷酸腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP responsive element binding protein,CREB)從而影響個(gè)體的學(xué)習(xí)和空間記憶，對(duì)海馬區(qū)的記憶功能鞏固發(fā)揮著關(guān)鍵作用[4-5]。但目前關(guān)于丙泊酚麻醉孕中期大鼠對(duì)子代海馬組織中CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路的影響的研究較少。因此，本研究探討丙泊酚麻醉孕中期大鼠對(duì)子代學(xué)習(xí)和記憶缺陷的影響，并觀(guān)察CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路在其中的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物、試劑與耗材 72只8周齡成年無(wú)特定病原體級(jí)SD雌性大鼠和24只雄性大鼠購(gòu)于新疆維吾爾自治區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK(新)2016-0001，質(zhì)量合格證號(hào)為NO.65000200000364]。生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth-associated protein 43,GAP43；批號(hào)：ab75810)、突觸后密度蛋白95(postsynaptic density protein 95,PSD95；批號(hào)：ab238135)、B細(xì)胞淋巴瘤蛋白-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2；批號(hào)：ab182858)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax；批號(hào)：ab32503)、Caspase3(批號(hào)：ab32351)、Cleaved-caspase3(批號(hào)：ab32042)、CaMKⅡ(批號(hào)：ab181052)、CREB(批號(hào)：ab32515)、磷酸化CREB(phosphorylated-3-CREB,p-CREB；批號(hào)：ab32096)和內(nèi)參蛋白GAPDH(批號(hào)：ab9485)一抗和二抗(批號(hào)：ab6721)均購(gòu)于美國(guó)Abcam公司；視頻跟蹤系統(tǒng)購(gòu)于上海移動(dòng)數(shù)據(jù)有限公司(型號(hào)：XR-XM101)；丙泊酚購(gòu)于美國(guó)Sigma Aldrich公司(批號(hào)：2078-54-8)，KN-93磷酸鹽購(gòu)于美國(guó)Selleck化學(xué)公司(批號(hào)：S7423)，尼氏染色試劑盒購(gòu)于上海碧云天公司(批號(hào)：C0117)，戊巴比妥鈉(分析純)購(gòu)于德國(guó)默克公司(批號(hào)：20160411)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境：成年SD大鼠飼養(yǎng)于在(24±1)℃的環(huán)境中，光照/黑暗周期為12 h/12 h，動(dòng)物自由攝食和飲水。所有實(shí)驗(yàn)程序和實(shí)驗(yàn)方案均獲得我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)[文號(hào)PHXUAR-LL-2020-0453-R]，并按照美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》[6]的原則，使所用動(dòng)物的總數(shù)及動(dòng)物的痛苦最小化。

1.2.2 孕鼠的麻醉劑暴露和剖腹探查術(shù)：將3只雌鼠與1只雄鼠關(guān)于一籠中(共24籠)，進(jìn)行自由交配。第2天通過(guò)目測(cè)觀(guān)察每只雌鼠的陰道栓子聯(lián)合陰道涂片檢測(cè)來(lái)判斷是否存在精子，如存在則認(rèn)為受孕成功，并定義為孕0 d，由此推算并選擇孕期為14 d的母鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(本研究中每只雌鼠均檢測(cè)到精子并存在陰道栓子)。于自制透明塑料瓶中固定孕期為14 d的72只雌性大鼠，采用腹腔注射2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)進(jìn)行麻醉，行頸內(nèi)靜脈穿刺放置靜脈導(dǎo)管。使用隨機(jī)數(shù)字表法將雌鼠分為4組，每組18只，其中對(duì)照組(C組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射2 mL/kg生理鹽水后不做任何處理；丙泊酚低劑量組(L組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射1.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉誘導(dǎo)，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注1.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術(shù)，麻醉時(shí)間4 h；丙泊酚中劑量組(M組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射1.5%的丙泊酚2 mL/kg進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注1.5%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術(shù)，麻醉時(shí)間4 h；丙泊酚高劑量組(H組)經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射2.0%的丙泊酚2 mL/kg行麻醉誘導(dǎo)，然后以20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注2.0%的丙泊酚2 mL/kg，并行剖腹探查手術(shù)，麻醉時(shí)間4 h。

1.2.3 剖腹探查術(shù)：以翻正反射消失作為動(dòng)物麻醉誘導(dǎo)成功的標(biāo)準(zhǔn)。成功麻醉誘導(dǎo)后剪去L組、M組、H組大鼠的腹毛，對(duì)露出的皮膚使用75%無(wú)菌酒精消毒3遍，使用0.125%丁哌卡因(0.2 mL/只)進(jìn)行局部麻醉，于腹部正中做一長(zhǎng)約3 cm的縱向切口。無(wú)菌探查腹腔范圍包括膈肌(肝臟)、盆腔、膀胱、兩側(cè)腹中線(xiàn)水平(脾臟或腎)；隨后用2 mL的37℃無(wú)菌生理鹽水沖洗腹腔，吸凈液體，用75%酒精消毒切口。采用4-0縫線(xiàn)間斷縫合腹膜和肌層，采用3-0縫線(xiàn)間斷縫合皮膚并消毒，擦干切口血漬。在25 min內(nèi)完成手術(shù)。大鼠蘇醒后放回原籠，繼續(xù)妊娠。

1.2.4 圍術(shù)期監(jiān)測(cè)：麻醉各組動(dòng)物后，采用RM6240生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)、血壓計(jì)、血?dú)夥治鰞x分別監(jiān)測(cè)其心電圖、血壓、血氧飽和度，麻醉結(jié)束后立即從母鼠髂外靜脈取血進(jìn)行血?dú)夥治觥Ｂ樽砥陂g監(jiān)測(cè)孕鼠血氧飽和度、血壓、心率，剔除血氧飽和度<95%或平均動(dòng)脈壓超出/低于基礎(chǔ)值20%的孕鼠。從上述4組中每組隨機(jī)選12只血氧飽和度、血壓、心率正常的孕中期大鼠，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.5 收集生殖發(fā)育參數(shù)：統(tǒng)計(jì)上述的48只孕鼠的妊娠時(shí)長(zhǎng)，即從孕0 d開(kāi)始到子代出生，以及子代大鼠的性別比例、數(shù)量和體重。

1.2.6 檢測(cè)子代的學(xué)習(xí)記憶功能：子鼠出生后30 d，從各組母鼠所產(chǎn)的所有雄性子代中按隨機(jī)數(shù)字表法選擇30只，進(jìn)行學(xué)習(xí)和空間記憶檢測(cè)(為排除發(fā)情周期對(duì)嚙齒動(dòng)物行為的影響，僅對(duì)雄性子代進(jìn)行了行為測(cè)試)。采用Morris水迷宮系統(tǒng)(美國(guó)CoulBOURN公司)檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能。將Morris水迷宮系統(tǒng)(直徑1.6 m、深0.6 m，第Ⅱ象限中有可移動(dòng)的圓柱形平臺(tái)直徑0.15 m)置于固定的測(cè)試間內(nèi)，每日8：00開(kāi)始測(cè)試，水溫(23±1)℃，第Ⅱ象限的平臺(tái)在水下1 cm，每日訓(xùn)練1次。第1～5天(出生后30～34 d)觀(guān)察大鼠的定位航行能力，即從離平臺(tái)最遠(yuǎn)的第Ⅲ象限選擇一固定入水點(diǎn)將大鼠背對(duì)平臺(tái)放入水中；若90 s內(nèi)大鼠找到平臺(tái)，則將其留在平臺(tái)上20 s，若90 s內(nèi)未能找到，將其引上平臺(tái)同樣停留20 s。記錄大鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期，若90 s內(nèi)未找到平臺(tái)，按90 s計(jì)算。第6天(出生后35 d)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤去水中平臺(tái)，于固定的進(jìn)入點(diǎn)將大鼠放入水中，記錄90 s內(nèi)在第Ⅱ象限停留時(shí)間及穿越原平臺(tái)次數(shù)。每次試驗(yàn)后，干燥大鼠毛發(fā)并用熱燈溫暖5 min，然后再放回常規(guī)籠。取所測(cè)雄性子代的平均值作為最終測(cè)定結(jié)果。

1.2.7 抑制劑注射和學(xué)習(xí)、空間記憶測(cè)試：由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示M組和H組劑量丙泊酚對(duì)子代學(xué)習(xí)記憶缺失的影響高于L組，且H組與M組子代學(xué)習(xí)記憶缺失的影響無(wú)明顯差異，因此選擇M組子代用于機(jī)制研究。于M組的雄性子代出生后36 d(測(cè)試完成后1 d)隨機(jī)選取6只，腹腔注射CaMKⅡ的特異性抑制劑KN-93磷酸鹽0.5 mg/kg，用生理鹽水溶解至2.5 mL，1次/d，持續(xù) 7 d (出生后36～42 d)，作為M+KN-93組。另取出生后36 d的M組雄性子代大鼠作為對(duì)照，腹腔注射2.5 mL生理鹽水(1次/d，持續(xù)7 d)，作為M+saline組。于出生后43～48 d使用Morris水迷宮法檢測(cè)大鼠子代的學(xué)習(xí)記憶能力。

1.2.8 Western blot分析：在C組、L組、M組、H組、M+KN-93組及M+saline組的子代大鼠完成最后一次Morris水迷宮測(cè)試后，采用隨機(jī)數(shù)字表法在每組選擇3只子代大鼠,斷頭法處死后分離腦海馬組織。海馬組織勻漿后用RIPA裂解緩沖液提取海馬組織總蛋白，用于測(cè)定GAP43、PSD95、凋亡標(biāo)志物(Bcl-2、Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase3、CaMKⅡ，CREB、p-CREB、GAP43、PSD95的表達(dá)。經(jīng)過(guò)SDS-PAGE分離并隨后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜與Bcl-2(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶500)、Caspase3(1 ∶500)、Cleaved-Caspase3( 1 ∶1 000)、CaMKⅡ(1 ∶1 000)、CREB(1 ∶600)、p-CREB(1 ∶800)、GAP43(1 ∶1 000)、PSD95(1 ∶500)和GAPDH(1 ∶1 000)的一抗4℃孵育過(guò)夜，用1×Western Wash Buffer洗滌3次，每次5 min。洗滌后用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的免疫球蛋白G抗體(二抗)孵育1 h，用1×Western Wash Buffer洗滌3次，每次5 min。通過(guò)增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法使蛋白條帶顯色，使用Amersham Biosciences ECL檢測(cè)系統(tǒng)掃描蛋白條帶，并通過(guò)ImageJ軟件進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.9 尼氏染色觀(guān)察神經(jīng)元的密度：選擇M+KN-93組及M+saline組的出生后48 d的子代大鼠各3只，經(jīng)斷頭法處死，先后用生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌流，然后取出腦組織，并在4℃下于4%多聚甲醛中固定過(guò)夜。石蠟包埋后，距前囟3.3 mm處行冠狀切片(厚4 μm)，并行尼氏染色。使用數(shù)字顯微鏡照相機(jī)(德國(guó)徠卡公司)捕獲CA1區(qū)域的錐體細(xì)胞層的代表性顯微照片。每只大鼠計(jì)算3張尼氏染色切片的細(xì)胞圖像。由兩名工作人員使用ImageJ軟件以盲法對(duì)尼氏染色陽(yáng)性神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。神經(jīng)元密度=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以(x±s)表示，組間采用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(采用LSD-t進(jìn)行多重比較)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對(duì)雌鼠生殖結(jié)局和子代體格發(fā)育參數(shù)的影響 4組雌鼠的妊娠時(shí)長(zhǎng)、每只雌鼠產(chǎn)仔數(shù)、子代雄雌比、雄性子代體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 4組雌鼠生殖結(jié)局和子代發(fā)育參數(shù)的比較(x±s)

2.2 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對(duì)子代學(xué)習(xí)記憶能力的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)均增加，平臺(tái)穿越次數(shù)均減少，第Ⅰ象限的停留時(shí)間均延長(zhǎng)，而第Ⅱ象限的停留時(shí)長(zhǎng)均縮短(均P<0.05)；與L組大鼠雄性子代相比，M組和H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)均增加，平臺(tái)穿越次數(shù)均減少，第Ⅱ象限的停留時(shí)長(zhǎng)均縮短(均P<0.05)；而M組和H組大鼠雄性子代上述指標(biāo)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 4組大鼠雄性子代Morris水迷宮系統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo)的比較(x±s)

組別n平臺(tái)穿越次數(shù)(次)各象限停留時(shí)間(s)ⅠⅡⅢⅣC組305.724±0.9729.213±1.45343.561±6.98827.536±4.03511.545±2.164L組303.584±0.671a18.891±3.094a32.564±3.162a26.563±4.31412.191±2.971 M組302.474±0.433ab17.244±2.552a19.672±2.711ab26.644±1.66012.094±2.385 H組302.094±0.213ab17.012±1.231a15.694±1.302ab27.941±2.32113.172±2.562 F值176.11682.652225.14521.55217.632P值0.0110.0310.0090.0620.115

2.3 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對(duì)子代海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代海馬區(qū)的Bax、Cleaved-Caspase3表達(dá)量均上調(diào)， Bcl-2、GAP43、PSD95表達(dá)量均下調(diào)(均P<0.05)；與L組比， M組、H組大鼠雄性子代海馬區(qū)的Bax、Cleave-Caspase3表達(dá)量均上調(diào)，Bcl-2、GAP43、PSD95表達(dá)量均下調(diào)(均P<0.05)；而4組大鼠雄性子代海馬區(qū)的Caspase3表達(dá)量，以及M組與H組上述蛋白表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)圖1、表3。

圖1 4組凋亡相關(guān)蛋白電泳條帶圖

表3 4組大鼠雄性子代海馬區(qū)凋亡相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.4 孕中期不同濃度丙泊酚暴露對(duì)子代海馬組織CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路激活的影響 與C組相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代海馬組織的CaMKⅡ蛋白表達(dá)量均上調(diào)，p-CREB蛋白表達(dá)量均下調(diào)；與L組相比，M組、H組大鼠雄性子代海馬區(qū)的CaMKⅡ蛋白表達(dá)量均上調(diào)，p-CREB蛋白表達(dá)量均下調(diào)(均P<0.05)；而4組大鼠雄性子代海馬區(qū)的CREB蛋白表達(dá)量，以及M組與H組上述蛋白表達(dá)量比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 4組CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路蛋白電泳圖

表4 4組大鼠雄性子代海馬區(qū)CaMKⅡ、CREB、p-CREB蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較(x±s)

2.5 KN-93磷酸鹽對(duì)大鼠雄性子代學(xué)習(xí)記憶能力的改善作用 在出生后48 d，與M+saline組相比，M+KN-93組大鼠雄性子代的逃避潛伏期變短，平臺(tái)穿越次數(shù)增加，第Ⅱ象限停留時(shí)間延長(zhǎng)，海馬組織中CaMKⅡ蛋白表達(dá)量下調(diào)，p-CREB、GAP43、PSD95蛋白表達(dá)量上調(diào)，神經(jīng)元細(xì)胞密度增加(均P<0.05)。見(jiàn)表5～6和圖3～4。

表5 兩組大鼠雄性子代Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果的比較(x±s)

表6 兩組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量和神經(jīng)元細(xì)胞相對(duì)密度的比較(x±s)

圖3 兩組雄性子代海馬區(qū)尼氏染色結(jié)果(×200)

圖4 兩組大鼠海馬區(qū)相關(guān)蛋白電泳圖

3 討 論

盡管既往已有研究證實(shí)在胎兒期接觸丙泊酚對(duì)其長(zhǎng)期神經(jīng)發(fā)育結(jié)局的影響，但研究結(jié)果仍存在爭(zhēng)議[7-8]。有研究表明， 2.5%丙泊酚單次暴露2 h可損害子代小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能[9]。然而，另一項(xiàng)類(lèi)似的研究表明，懷孕小鼠接觸丙泊酚不會(huì)導(dǎo)致子代小鼠出現(xiàn)學(xué)習(xí)行為異常[10]。上述研究之間的差異可能與物種、麻醉方案的差異(確切孕齡、麻醉劑類(lèi)型、劑量、暴露時(shí)間等)或行為測(cè)試的敏感性有關(guān)。本研究采用孕14 d的大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，此階段被認(rèn)為與人類(lèi)妊娠的孕中期相似[11]。本研究中孕中期大鼠丙泊酚的暴露方式為：經(jīng)頸內(nèi)靜脈注射(1.0%、1.5%、2.0%)2 mL/kg丙泊酚進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)，然后以 20 mg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵注丙泊酚，并行剖腹探查手術(shù)，麻醉時(shí)間為 4 h，該時(shí)間長(zhǎng)度與臨床真實(shí)情況更類(lèi)似。然而在一些臨床手術(shù)中，為了放松子宮平滑肌并為胎兒干預(yù)提供足夠的麻醉，胎兒腦部可能會(huì)遭受到濃度更高的麻醉劑造成的損害[12]。因此，本研究觀(guān)察不同濃度(1.0%、1.5%、2.0%)的丙泊酚麻醉對(duì)大鼠子代學(xué)習(xí)記憶的影響。本研究結(jié)果顯示，C組、L組、M組、H組雌性大鼠的妊娠期、每只雌鼠產(chǎn)仔數(shù)、子代雄雌比、雄性子代體重比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，說(shuō)明孕中期接觸丙泊酚未對(duì)雌性大鼠生殖結(jié)局和雄性子代體格發(fā)育造成影響。本研究的Morris水迷宮測(cè)試結(jié)果表明，與C組大鼠雄性子代相比，L組、M組、H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)均增加，平臺(tái)穿越次數(shù)均減少，第Ⅰ象限的停留時(shí)間均延長(zhǎng)、第Ⅱ象限的停留時(shí)長(zhǎng)均縮短(均P<0.05)；與L組大鼠雄性子代相比，M組和H組大鼠雄性子代出生后31～34 d的逃避潛伏時(shí)長(zhǎng)均增加，平臺(tái)穿越次數(shù)均減少，第Ⅱ象限的停留時(shí)長(zhǎng)均縮短(均P<0.05)；而M組和H組大鼠雄性子代上述指標(biāo)比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。這說(shuō)明孕中期大鼠接觸低、中、高濃度的丙泊酚均能引起雄性子代的學(xué)習(xí)和記憶能力部分缺失，且中、高濃度丙泊酚的作用更明顯。

研究表明，CaMKⅡ的磷酸化或激活對(duì)海馬區(qū)的記憶的鞏固發(fā)揮著關(guān)鍵作用[13]，而且海馬CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路在藥物誘導(dǎo)學(xué)習(xí)記憶功能衰退中具有重要意義。已有研究證實(shí)CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路介導(dǎo)了重金屬誘導(dǎo)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力衰退，其中海馬區(qū)CaMKⅡ激活受到抑制和CREB激活(CREB磷酸化)增加是改善認(rèn)知功能障礙的關(guān)鍵[14]。本研究結(jié)果顯示，不同濃度丙泊酚麻醉孕中期大鼠后，其雄性子代的學(xué)習(xí)記憶能力明顯降低。Caspase3經(jīng)過(guò)切割、活化之后會(huì)變成Cleaved-Caspase3，而后者是高活性的細(xì)胞凋亡激活酶，本研究結(jié)果顯示，各丙泊酚干預(yù)組中海馬區(qū)Cleaved-Caspase3表達(dá)量增加，同時(shí)凋亡標(biāo)志物Bax蛋白表達(dá)量也增加，而且凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)量降低(均P<0.05)，這表明丙泊酚對(duì)海馬神經(jīng)元可能有促凋亡的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，各丙泊酚干預(yù)組中大鼠雄性子代大腦海馬區(qū)CaMKⅡ的激活增加以及CREB的激活減少，表現(xiàn)為CaMKⅡ的磷酸化水平上調(diào)，而CREB的磷酸化受到抑制，而且中、高濃度丙泊酚的作用更明顯；使用CaMKⅡ抑制劑抑制其激活時(shí)，伴隨著海馬區(qū)CREB激活的增加，子代大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力明顯恢復(fù)。這些結(jié)果表明丙泊酚麻醉孕中期大鼠可通過(guò)激活CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路影響雄性子代的學(xué)習(xí)、記憶能力。另外，本研究結(jié)果顯示，不同濃度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠可降低其雄性子代海馬區(qū)突觸可塑性相關(guān)蛋白PSD95和GAP43的表達(dá)量，而有趣的是，當(dāng)使用CaMKⅡ抑制劑抑制其激活后，大鼠雄性子代海馬組織的神經(jīng)元細(xì)胞密度增加，而且海馬區(qū)PSD95和GAP43蛋白的表達(dá)量均上調(diào)。這表明海馬區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目及PSD95、GAP43表達(dá)可能受到CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路調(diào)節(jié)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路在海馬神經(jīng)元保護(hù)和突觸可塑性中的主導(dǎo)作用[15]。

本研究存在幾個(gè)局限性：首先，由于為了減少實(shí)驗(yàn)中處死動(dòng)物的數(shù)量，本研究?jī)H選擇中劑量丙泊酚組(M組)大鼠的子代作為機(jī)制研究，所得結(jié)果可能會(huì)有偏倚；其次，為避免子代大鼠受發(fā)情期的影響，本研究中僅選用大鼠雄性子代作為研究對(duì)象，丙泊酚對(duì)于大鼠雌性子代的影響仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，使用不同濃度的丙泊酚麻醉孕中期大鼠均會(huì)導(dǎo)致雄性子代的學(xué)習(xí)、記憶功能下降，并伴有海馬組織CaMKⅡ蛋白表達(dá)上調(diào)及CREB激活程度降低，抑制CaMKⅡ表達(dá)可提高大鼠雄性子代的學(xué)習(xí)、記憶功能，其作用機(jī)制可能與CREB激活有關(guān)，CaMKⅡ/CREB信號(hào)通路可能是治療孕中期丙泊酚暴露致子代學(xué)習(xí)、記憶能力缺失的關(guān)鍵靶點(diǎn)。