基于網絡藥理學方法探討當歸芍藥散治療帕金森病的作用機制▲

倪炯臣 張雷雷 李思詩 張 偉

(1 陜西省商洛市商南縣醫院神經內科，商洛市 726300，電子郵箱：1445792501@qq.com； 2 陜西中醫藥大學第一臨床醫學系中西醫結合臨床，咸陽市 712046； 3 陜西省西安市中醫醫院腦病科，西安市 710021)

帕金森病又稱震顫麻痹，是繼阿爾茨海默病之后的第二大神經退行性疾病，臨床表現以靜止性震顫、運動遲緩、肌強直、姿勢步態障礙為主[1]。預計2040年全球帕金森病患者總數將超過1 400萬例[2]，65歲以上人群的患病率將超過1%[3]。在我國，2005年50歲以上人群的帕金森病患病率約為1%，65歲以上人群的患病率高達1.7%[4]。據統計，2016年我國帕金森病患者已達200萬人，隨著人口老齡化進展加速，預計到2030年帕金森病患者數量將增加到500萬[5]。帕金森病的發病機制至今尚未完全闡明，其病理特征是黑質-紋狀體多巴胺能神經元的大量退化和進行性缺失，這與α-突觸核蛋白(α-synuclein，α-Syn)積聚、神經免疫炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、谷氨酸的毒性作用、細胞凋亡有關[6]。目前，主要是通過調節多巴胺能通路治療帕金森病，其中左旋多巴制劑、多巴胺受體激動劑因對肌強直、震顫、運動遲緩等癥狀有顯著療效而被廣泛使用，成為治療帕金森病的主要藥物[7]，但大劑量、長期服用這些藥物會出現癥狀波動、運動障礙，甚至情感障礙加重等不良反應，并且不能阻斷疾病進程[8]。

帕金森病歸屬于中醫的“顫證”“震顫”等范疇。當歸芍藥散出自張仲景所著的《金匱要略》，全方由當歸、芍藥、茯苓、白術、澤瀉、川芎組成。其中當歸養血活血止痛，白芍養血柔肝、和血通脈，赤芍清熱涼血、散瘀止痛，白術補氣健脾、燥濕利水；茯苓、澤瀉、川芎共助血分藥發揮活血利水、通經活絡的功效。全方養血、柔肝、健脾并舉。當歸芍藥散最早被日本學者牧田憲氏認為是治療阿爾茨海默病的首選經方，療效顯著[9]。此外，水島宣昭[10]發現，使用當歸芍藥散可以改善癡呆患者的運動機能和智能。而葉玉紅[11]的研究也顯示，當歸芍藥散治療可以提高老年性癡呆患者的日常生活能力和智力。

將當歸芍藥散用于治療帕金森病已有先例。田丹楓等[12]應用柴胡龍骨牡蠣湯合當歸芍藥散加減治療帕金森病老年患者上半身振搖及腿腳攣急，治療半個月后患者上半身振搖明顯緩解；玉井敏弘[13]在臨床上觀察發現，應用當歸芍藥散治療帕金森病性癡呆的療效顯著，并證實當歸芍藥散的活血化瘀作用可通過改善腦微循環、降低血液黏度，發揮治療帕金森病癡呆癥狀的作用。基于當歸芍藥散可用于治療帕金森病的臨床基礎，本文采用網絡藥理學方從分子水平上分析當歸芍藥散治療帕金森病的機制，通過細胞實驗驗證該方治療帕金森病的相關靶點，從而進一步探討其治療帕金森病的可行性，為中藥治療帕金森病提供理論證據。

1 材料與方法

1.1 當歸芍藥散活性成分及其靶點基因的篩選 采用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(https://tcmsp-e.com/)，以口服生物利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和藥物相似性(drug-likeness，DL)≥0.18為標準進行檢索，檢索時間為建庫至2020年6月4日。因唐末宋初將當歸芍藥散中的芍藥分為赤芍、白芍，本研究進行中藥成分及相應靶點的查詢及篩選時，將白芍與赤芍共同納入。通過檢索并刪除重復成分，獲得當歸芍藥散的活性成分。應用該數據庫進一步檢索活性成分作用的靶點，刪除重復及非“Homo sapiens”類型的靶點，并經UniProt數據庫(www.uniprot.org)進行校正獲得當歸芍藥活性成分的靶點。

1.2 疾病相關靶點的篩選 在GeneCards數據庫(www.genecards.org)、MalaCards數據庫(www.malacards.org/)、DisGeNET數據庫(www.disgenet.org)、Therapeutic Target Database 數據庫(http://www.db.idrblab.net/ttd/)、OMIM數據庫(https://www.omim.org/)、UniProt數據庫(http://www.uniprot.org)中，以“Parkinson′s disease”為檢索詞進行篩選，檢索時間為建庫至2020年6月4日。去除重復并經UniProt數據庫校正后，獲得帕金森病相關的靶點。

1.3 共同靶點的篩選及蛋白質-蛋白質互相作用網絡的構建 使用R語言軟件繪制韋恩圖，將活性成分靶點與帕金森病相關靶點取交集。將共同靶點輸入至STRING 11.0數據庫(http://www.string-db.org)中，設置條件為“Homo sapiens”，構建共同靶點的蛋白質-蛋白質互相作用(protein-protein interaction,PPI)網絡，評分條件設定為>0.4，隱藏孤立蛋白，其他參數保持默認設置。利用Cytoscape軟件的CytoHubba插件統計出共同靶點的Degree值，獲得關鍵蛋白(Degree值>30)。

1.4 共同靶點的功能和通路富集分析 采用DAVID 6.8數據庫(http://www.david.ncifcrf.gov)進行基因本體論(Gene Ontology,GO)富集分析(包括生物過程、細胞組分、分子功能)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。以“P<0.01，基因數>8”作為條件進行篩選，得到共同靶點的主要生物功能及發揮作用的主要通路，并利用R 語言軟件繪制氣泡圖。

1.5 細胞實驗

1.5.1 實驗藥物：所用中藥材均購自西安市中醫醫院藥劑科，經生藥學分析鑒定其原植物分別為當歸、赤芍、茯苓、白術、澤瀉、川芎。按原方比例(當歸9 g、赤芍48 g、茯苓12 g、白術12 g、澤瀉24 g、川芎24 g)水煎2次，過濾濃縮至所需濃度。

1.5.2 含藥血清的制備：雄性C57BL/6小鼠10只，8周齡，體重23～28 g，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供[動物生產許可證：SCXK(陜)2019-001]。飼養環境12 h光照，室溫控制在(23±1)℃，單籠飼養，自由進食、進水，適應1周后進行實驗。所有實驗操作過程均嚴格遵守實驗動物管理和保護的規定。采用隨機數字表法將10只小鼠隨機分為空白對照組與當歸芍藥散組各5只。當歸芍藥散組按臨床等效劑量的10倍(47 g生藥/kg體重)進行灌胃，2次/d，共5次。于末次灌胃后1 h，采用混合濃度為3%～4%的乙醚與氧氣麻醉小鼠，無菌條件下，經腹主動脈取血1 mL，4℃靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，分離含藥血清。將同組小鼠含藥血清混勻，56℃水浴30 min以滅活血清，經0.45 μm微孔濾膜過濾除菌后凍存管分裝，-20℃保存備用[14]。以相同條件分離空白對照組小鼠的血清。

1.5.3 細胞培養：人源神經母瘤細胞系SH-SY5Y細胞因具有中等水平的多巴胺β羥化酶活性，而被廣泛應用于帕金森病的體外機制研究[5]，故本研究選擇該細胞進行實驗，細胞由空軍軍醫大學唐都醫院神經外科實驗室惠贈。設定培養條件為溫度37℃、5% CO2，培養基液為含10%胎牛血清(美國Gibco公司，批號：10100147C)的杜氏改良依格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM；美國Corning公司，批號：10-017-CV)。細胞密度達到50%～60%時可用于實驗。

1.5.4 實驗分組：(1)對照組采用空白對照組血清處理SH-SY5Y細胞，在37℃、5% CO2的條件下處理24 h。(2)當歸芍藥散組給予當歸芍藥散濃度為100 ng/mL的含藥血清(采用高壓過的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mg/mL，6孔板中2 mL的培養體積給藥劑量為4 μL)，在37℃、CO2含量為5%的條件下處理24 h。(3)1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpyridiniumion,MPP+)組，給予500 μmol/L的MPP+(美國Sigma公司，批號：D048；采用高壓過的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mmol/L，6孔板中2 mL的培養體積給藥劑量為20 μL)，在37℃、5% CO2的條件下處理24 h。(4)當歸芍藥散+MPP+組，給予當歸芍藥散濃度為100 ng/mL的含藥血清(采用高壓過的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mg/mL，6孔板中2 mL的培養體積給藥劑量為4 μL)，在37℃、5% CO2的條件下預處理24 h后，再給予500 μmol/L的MPP+(采用高壓過的雙蒸水配制母液，母液濃度為50 mmol/L，6孔板中2 mL的培養體積給藥劑量為20 μL)在37℃、5% CO2的條件下處理24 h。采用6孔板進行實驗，每孔細胞接種量為1.0×106個。

1.5.5 Western blot檢測：分組處理后，經4℃磷酸緩沖鹽溶液沖洗2次，加入1 mL RIRA裂解液對細胞進行裂解。采用二喹啉甲酸法進行蛋白定量后，取15 μg總蛋白行SDS-PAGE，電泳結束后，進行電轉印，將蛋白轉至聚偏二氟乙烯膜。于含2%牛血清白蛋白封閉溶液中室溫下孵育2 h。一抗包括鼠抗α-Syn(美國CST公司，批號：51510；稀釋比例1 ∶1 000)，兔抗活化型Caspase3(美國CST公司，批號：9661；稀釋比例1 ∶1 000)、兔抗活化型Caspase9(美國CST公司，批號：7237；稀釋比例1 ∶1 000)、兔抗Parkin(美國CST公司，批號：2132；稀釋比例1 ∶1 000)、兔抗PTEN誘導假定激酶1(PTEN-induced putative kinase 1,PINK1；美國CST公司，批號：6946；稀釋比例1 ∶1 000)，內參鼠抗β-actin(上海生工生物工程股份有限公司，批號：D191048；稀釋比例1 ∶2 000)。二抗包括辣根過氧化物酶結合親和純山羊抗兔IgG(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：SA00001-2；稀釋比例1 ∶5 000)和辣根過氧化物酶結合親和純山羊抗鼠IgG(武漢三鷹生物技術有限公司，批號：SA00001-1；稀釋比例1 ∶5 000)。按照說明書，加入稀釋后的一抗，4 ℃環境下孵育過夜，然后加入二抗，繼續室溫孵育2 h。采用全能型凝膠成像分析系統(美國Bio-Rad公司)進行成像，經LabImage軟件(德國Kapelan公司)進行分析，計算各個蛋白的相對表達水平。

1.6 統計學分析 采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 當歸芍藥散的活性成分及其靶點、帕金森病相關靶 獲得當歸芍藥散活性成分共83個，其中當歸2個、白芍13個、赤芍29個、茯苓15個、白術7個、澤瀉10個、川芎7個，部分活性成分見表1。共獲得活性成分相應靶點420個，刪除重復及非“Homo sapiens”類型的靶點，并經UniProt數據庫校正后獲得靶點141個。聯合多個數據庫檢索并去重后共獲得帕金森病相關的靶點8 192個。

表1 當歸芍藥散的部分活性成分

2.2 共同靶點的篩選結果以及PPI網絡 共獲得活性成分作用靶點與帕金森病相關靶點的共同靶點111個(見圖1)。 將111個共同靶點導入STRING數據中，結果顯示共有110個蛋白(其中IGHG1未檢索到“Homo sapiens”)發生相互作用，交聯數為1 042條(P<1.0×10-16)，見圖2。利用Cytoscape軟件CytoHubba插件統計，出現Degree值≥30的關鍵蛋白共19個，依次為白細胞介素(interleukin,IL)6、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、腫瘤蛋白P53(tumor protein P53,TP53)、Fos原癌基因AP-1轉錄因子亞單位(Fos proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit,FOS)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、前列腺素內過氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)8、Caspase3、 一氧化氮合酶3(nitric oxide synthase 3,NOS3)、基質金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)、雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)、RELA原癌基因核因子κB亞單位、血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HMOX1)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor γ,PPARG)、雄激素受體(androgen receptor,AR)、細胞色素C，體細胞(cytochrome C，somatic，CYCS)、細胞間黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICAM1)、缺氧誘導因子1 (hypoxia-inducible factor 1,HIF-1)A，這些蛋白即為當歸芍藥散治療帕金森病的關鍵蛋白，見圖3。

圖1 韋恩圖

圖2 共同靶點的PPI網絡

圖3 當歸芍藥散治療帕金森病的關鍵蛋白

2.3 GO功能富集分析和 KEGG通路分析 GO功能富集分析結果顯示，共同靶點設涉及的細胞組分包括細胞核、細胞連接、突觸后膜等(見圖4A)，主要正向調控RNA聚合酶Ⅱ啟動子的轉錄、血管生成、細胞分裂、蛋白質寡聚化等生物學過程(見圖4B)，負向調控蛋白結合、鈣離子轉運、平滑肌細胞增殖、雙細胞緊密連接組件等生物學過程(見圖4C)，并調控膽堿能突觸傳遞、DNA模板轉錄、腺苷酸環化酶抑制G蛋白偶聯乙酰膽堿受體信號通路等調控的生物學過程(見圖4D)。KEGG富集分析結果顯示，共同靶點基因可以通過TNF信號通路、鈣信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路等多條信號通路發揮作用(見圖4E、圖5)。

A 前10條細胞組分

E 前10條KEGG信號通路

圖5 共同靶點的KEGG-帕金森病通路分析

2.4 Western blot結果 MPP+組的PINK1和Parkin蛋白表達水平較對照組下降(均P<0.05)，當歸芍藥散+MPP+組的PINK1和Parkin蛋白表達水平較MPP+組上升(均P<0.05)。MPP+組的α-Syn、活化型Caspase9、活化型Caspase3蛋白表達水平較對照組上升(均P<0.05)，當歸芍藥散+MPP+組的α-Syn、活化型Caspase9、活化型Caspase3蛋白表達水平較MPP+組下降(均P<0.05)。見圖6、表2。

圖6 蛋白印跡試驗結果

表2 4組細胞PINK、Parkin、a-Syn、活化型Caspase9、活化型Caspase3蛋白相對表達水平的比較(x±s)

3 討 論

本研究結果顯示當歸芍藥散的主要成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、芍藥苷、兒茶素等。有研究顯示，豆甾醇通過下調核因子κB p65和p38MAPK的表達，顯著抑制促炎介質(TNF、IL-6、IL-1、iNOS和環氧化酶2)的表達，促進抗炎細胞因子(IL-10)的表達[15]。研究表明，兒茶素對血管生成和血管炎癥具有調節作用，且這類作用主要取決于VEGFA的水平，通過核因子κB依賴的途徑抑制IL-1β依賴的上皮細胞促炎信號轉導，進而發揮抗炎作用[16]。芍藥苷是方中芍藥的主要活性成分，可通過激活腺苷A1受體來發揮保護神經元的作用[17]；另外，芍藥苷可抑制炎癥和凝血激活，減輕脂多糖誘導的彌散性血管內凝血[18]，還可通過抑制Src蛋白活化減少血管內皮細胞-鈣黏附素的降解，從而增加血管內皮細胞-鈣黏附素的表達，以使血管內皮細胞通透性降低，內皮細胞間連接更加緊密[19]。由此推測，當歸芍藥散中豆甾醇、芍藥苷、兒茶素等有效成分通過抑制炎癥介質的表達，發揮抗炎、調節血管生成、抑制血管炎癥和凝血激活作用，最終達到保護大腦神經元的目的，有效延緩黑質-紋狀體多巴胺能神經元的退化和進行性缺失[20]。因此，當歸芍藥散對帕金森病患者的黑質神經元具有保護作用，可以延緩帕金森病患者的病程進展，改善帕金森患者的運動遲緩癥狀[21]。

本研究通過PPI網絡分析，共篩選出19個當歸芍藥散治療帕金森病的關鍵蛋白，包括IL-6、VEGFA、TNF、ESR1、PTGS2等。研究表明，多種神經變性疾病的發生和發展與神經免疫炎性反應密切相關，炎癥反應在帕金森病的發病機制中也發揮了一定的作用[22]。IL-6是一種多功能細胞因子，帕金森病患者的腦內黑質紋狀體系統、腦脊液及腓腸神經中廣泛存在IL-6的結合位點[23]，其可促進黑質紋狀體多巴胺神經元壞死，引起帕金森病相關的病理性改變。另有研究顯示，帕金森病患者存在周圍感覺神經損傷并伴有施萬細胞的活化和炎癥，可能機制是炎癥反應參與了軸突變性，使軸突與施萬細胞的接觸功能障礙[24]，表明周圍神經炎癥參與了帕金森病的病理生理過程。VEGFA是已知的研究最深入和最有效的促血管生成因子，其表達紊亂是血管生成異常的分子基礎，在炎癥的基礎上，VEGFA促使血管生成，這在很大程度上導致了血管系統的功能失調、血管通透性升高、血腦屏障遭受破壞，使得外周血細胞因子進入中樞系統，從而引起相應帕金森病癥狀[25]。此外，慢性炎癥狀態也是主要的血管生成刺激因素之一，TNF-α是單核巨噬細胞分泌的一種多效性調節因子，廣泛參與機體的炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡和腫瘤的發生，是機體炎性反應的重要介質，而帕金森病患者外周血中的TNF-α 水平異常[26]，提示帕金森病發病過程中可能存在炎癥反應和免疫系統的失調。另外，ESR1對中樞神經系統具有神經保護作用[26]，其可能是通過抑制IL-6產生而發揮作用[27]。PTGS2的高表達與神經元凋亡有關[28]。研究顯示，PTGS2抑制劑對帕金森病動物模型中的多巴胺能神經元具有保護作用，并能減輕多巴胺能神經元的損傷[29]，這表明PTGS2可能通過作用于神經遞質參與帕金森病的發病過程。由此推測，當歸芍藥散可能通過調控炎癥反應、免疫反應、細胞凋亡來發揮治療帕金森病的作用。

此外，CYCS、CAT、Caspase3也是當歸芍藥散治療帕金森病的關鍵蛋白。抗氧化狀態異常不僅局限于黑質紋狀體，還存在于外周紅細胞和多形核白細胞中[29]。研究表明，初發帕金森病患者的機體中存在氧化應激反應或者異常的抗氧化狀態[30]，氧化應激可能參與了帕金森病的發病機制。而帕金森病患者CYCS與炎癥因子及氧化應激指標之間具有相關性[31]。CAT是一種含血紅素的抗氧化酶，有學者發現帕金森病患者外周紅細胞和多形核白細胞中的CAT活性顯著降低[32]；同時，血漿CAT活性下降與帕金森病患者姿勢不穩定步態障礙評分增加有關[33]。由此可見，當歸芍藥散可能通過調控這些關鍵靶標來發揮抗炎和抗氧化應激的作用，從而達到治療帕金森病的目的。Caspase是一組存在于胞質溶膠中的半胱氨酸蛋白酶，其主要介導細胞凋亡和壞死[34]，在帕金森病的病理過程中發揮著重要作用。同時Caspase是本研究篩選出的關鍵蛋白之一，細胞實驗中也涉及了該指標。研究證實，帕金森患者黑質-紋狀體多巴胺能神經元的大量退化和進行性缺失可進一步激活Caspase蛋白，從而啟動細胞凋亡[35]。本研究的細胞實驗結果顯示，當歸芍藥散+MPP+組活化型Caspase3蛋白的表達水平較MPP+組下降(P<0.05)。這提示，當歸芍藥散可能通過下調Caspase的表達，抑制由其介導的神經細胞凋亡，從而發揮對帕金森患者神經元的保護作用。

本研究的KEGG富集分析結果顯示，當歸芍藥散對帕金森病的治療作用與TNF信號通路、鈣信號通路、HIF-1 信號通路、Toll樣受體信號通路等多條信號通路有關。N-甲基-D-天冬氨酸型受體被谷氨酸激活后，參與鈣信號通路，導致細胞外大量的外鈣離子內流，細胞內鈣離子的大量增加激活了鈣離子依賴性蛋白酶，導致神經元壞死、凋亡[22]。HIF-1信號通路主要由HIF-1及其調節子von Hippel-Lindau腫瘤抑制因子調控，能激活和調控VEGFA、NOS等帕金森病發病過程中的重要促炎細胞因子；此外，HIF-1誘導TP53積累后介導的黑質或全身性炎性反應是帕金森病發病的重要過程[36]。在中樞神經系統中，Toll樣受體主要表達于具有免疫功能的膠質細胞中，在炎癥反應以及免疫細胞的調節、存活和增殖中發揮顯著作用，其與IL-1受體相關激酶-4結合后，膠質細胞發生磷酸化而被激活，然后Toll樣受體與細胞表面TNF受體相關因子6結合，最后導致抗炎因子c-Jun氨基末端激酶和核因子κB的表達，從而發揮負向調節作用[37]。綜上，當歸芍藥散可能通過參與鈣離子信號通路、HIF-1信號通路、Toll樣受體信號通路等多條信號通路，發揮保護神經元、抑制神經元細胞凋亡的作用，特異性抑制Toll樣受體的表達以阻斷神經炎癥過程，可降低小膠質細胞的活化，減少促炎癥因子TNF-α、IL-1β等的表達，從而治療帕金森病。

α-Syn是存在于神經元突觸前末端的神經元蛋白，α-Syn過度聚集可能是帕金森病發病的重要機制。本研究中，MPP+組的α-Syn蛋白表達水平上調，但當歸芍藥散+MPP+組的α-Syn蛋白表達水平較MPP+組下降(P<0.05)，提示當歸芍藥散可能是一種有效的α-Syn聚集抑制劑，其通過抑制α-Syn在神經元的過度聚集而發揮神經保護作用。PINK1是一種存在于線粒體內膜的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PINK1的N端則主要定位于線粒體外膜，Parkin是一種泛素E3連接酶。研究表明，PINK1/Parkin通路通過調控泛素-蛋白酶體系統、線粒體質量和自噬來保護細胞免受各類應激引起的損害[38]。PINK1能選擇性地聚集在去極化的線粒體外膜上，通過泛素鏈的磷酸化募集并激活Parkin，最終誘導受損的線粒體自噬降解[39]。同時，Parkin 可以增強受損線粒體的自噬[40]。二者能有效維持線粒體的形態、功能和DNA的穩定，進而保護線粒體DNA免受活性氧的損傷，并激發線粒體的自我修復過程[41]。有研究顯示，在帕金森病小鼠模型中，Parkin過表達能預防神經毒素誘導的氧化應激，防止MPP+誘導的多巴胺能神經元變性和運動功能障礙[42]。在PINK1缺失的小鼠中，黑質致密部的多巴胺能神經元對MPP+誘導的神經元變性更敏感，過表達PINK1可以減少MMP+誘導的SH-SY5Y細胞的凋亡，其作用機制可能是通過阻斷線粒體中細胞色素C的釋放和活化型Caspase3的激活而發揮作用[43]。蛋白酶激活被認為是細胞凋亡中的重要一步，內源性途徑主要以線粒體作為細胞凋亡的調控中心，損傷后釋放出的細胞色素C與凋亡蛋白酶激活因子Bax及Caspase9結合形成凋亡小體，而被活化的活化型Caspase9則繼而激活活化型Caspase3，引起細胞凋亡[44-45]。本研究結果顯示，MPP+組，PINK1和Parkin蛋白的表達較對照組下降，而活化型Caspase9和活化型Caspase3蛋白的表達均較對照組增加，而當歸芍藥散+MPP+組PINK1和Parkin蛋白的表達較MPP+組上升，且活化型Caspase9和活化型Caspase3蛋白的表達均較MPP+組有所下降(均P<0.05)。這表明，在帕金森病的細胞模型中，當歸芍藥散的含藥血清可以顯著增加泛素鏈的磷酸化，減少活化型Caspase9和活化型Caspase3的表達，從而達到抑制MPP+誘導的神經毒性的作用，發揮保護多巴胺能神經元的作用。

綜上所述，當歸芍藥散可通作用于IL-6、VEGFA、TNF、CAT、PTGS2等多靶點，以及調節TNF信號通路、鈣信號通路、HIF-1 信號通路、Toll樣受體信號通路等，發揮治療帕金森病的作用。但具體作用機制有待于進一步開展動物實驗研究深入探討，后續也還需要深入探討長期有效控制病情穩定的治療方案，為中醫藥防治帕金森病提供新的思路。