毛地黃鼠尾草在不同授粉條件下的繁殖成功與花性狀選擇

張勃，孫淑范

（甘肅農業大學草業學院，草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070）

普遍認為，被子植物花的多樣性進化在很大程度上是由傳粉者介導的自然選擇所驅動［1-3］。近年來，大量的進化生態學研究顯示，植物花性狀選擇在自然種群普遍發生［4］，傳粉者類群的轉變在植物物種或種群分化中發揮著關鍵作用［5-6］。但是，目前有關植物傳粉者介導選擇的定量估測研究相對較少［7-8］，從而限制了對傳粉者作為選擇媒介（selective agent）促進花表型進化過程的理解。

花表型選擇發生，需要同時滿足兩個基本條件：首先，植物的花性狀表達（trait expression）在自然種群中存在個體間的變異性［9］；其次，不同的花性狀能通過與選擇媒介（如傳粉昆蟲）的互作引起個體間繁殖適合度（reproductive fitness）的變異［10］。也就是說，當種群內不同個體因為花性狀變異而獲得不同的傳粉機會（或效率），從而導致個體間繁殖適合度存在差異時，傳粉者介導的選擇才能夠發生［5］。植物通常有兩類花性狀會通過影響昆蟲傳粉而受到傳粉者選擇［11-12］。一類是花吸引（傳粉昆蟲）相關性狀，如花大小、數量［13］和花報酬［14］等，這類性狀可通過影響昆蟲訪花頻率影響植物個體的傳粉機會，進而影響其繁殖成功。另一類是植物的花部結構性狀［15］，特別是花藥和柱頭的相對位置以及花冠結構等，這類性狀可通過與傳粉者的機械互作影響植物的傳粉效率和交配成功［16］，從而影響其繁殖適合度。

鼠尾草（Salvia）是唇形科（Lamiaceae）最大的一個屬，被認為是研究植物花適應性進化的理想類群［17］。該屬絕大多數物種具有高度特化的杠桿狀雄蕊結構（lever-like stamens）和背部傳粉機制［18］。有學者認為，這種特殊花結構及其與傳粉者形成的傳粉互作系統是激發該屬物種適應性分化的“關鍵性狀”（a key innovation）［19］；因此，該植物的花性狀進化和選擇機制成為學者普遍關注的科學問題。針對該屬植物的花表型進化，前人已在其系統發育［20］、傳粉生態［21-22］、花結構功能與適應性［23-24］以及性系統的多樣性分化［18，25］等方面展開了深入研究。其中，Zhang 等［17］通過對毛地黃鼠尾草（Salvia digitaloides）的花適應性研究發現，該物種的花產量及雄蕊杠桿相關花性狀受到強烈的自然選擇，但是其選擇機理（包括選擇媒介）仍不清楚。基于此，本研究通過人工輔助授粉創造不同的傳粉環境，比較了該植物在不同花粉供給條件下的繁殖成功和花性狀選擇，探討了花性狀在當前自然種群的適應性及其選擇機理。具體關注如下兩個問題：1）在自然種群，毛地黃鼠尾草的繁殖是否受到花粉限制？2）該植物的哪些花性狀受傳粉者介導的選擇，其選擇強度和選擇模式是什么？

1 材料與方法

1.1 試驗地點和材料

本試驗于 2018年 5-6月進行，試驗地位于云南省麗江市甘海子（27°0′54″N，100°14′41″E），海拔 2419 m；毛地黃鼠尾草是該地區常見的優勢草本植物。該物種屬于唇形科弧隔鼠尾草亞屬（subgenusSalvia），主要分布于我國云南西北部和四川西南部。本研究種群特征為：花乳白色，花冠口及唇瓣有紅色或紫紅色斑點；花期為4月底到5月中旬，單花有4個胚珠，小堅果呈灰黑色。

1.2 試驗設計與方法

初花期，在毛地黃鼠尾草種群隨機選擇150個開花狀態相同的單株，每株同時標記大小基本一致且尚未開放的2個花序。其中，一個花序作對照，使其自然授粉；另一個花序作處理，進行人工輔助授粉。待所標記的花序開花后，對處理花序上每朵新開放的小花進行1～2 次人工輔助授粉，直至所有小花開敗萎蔫。授粉時，用柔軟毛刷蘸取采自周圍未標記花序的混合花粉，輕觸花柱頭即可。

1.2.1 花性狀測量 待標記植株處于盛花期時，在每個個體上選擇4～5 朵花，用電子游標卡尺（精度為0.01 mm）測量其花冠長、花冠口高度和寬度、柱頭高度以及柱頭探出花冠距離（即柱頭探出距離）5個花部結構性狀。具體測量方法參照 Zhang 等［17，25］的方法。

1.2.2 適合度估測 待毛地黃鼠尾草種子成熟后（花后15 d 左右），采集所有標記花序，統計其坐果數和結籽數；同時，根據花序上留存的花柄數量統計每個花序的花數量，并在花序基部測量每個花序的莖粗，以此作為個體大小的測度。用每個處理花序的坐果率（坐果數/花數量）和結籽率（種子數/花數量）估測個體的繁殖效率，用結籽數（種子數）估測其繁殖適合度。

1.2.3 花粉限制程度估測個體的花粉限制程度用個體在花粉限制下的繁殖效率折損來估測。坐果率（或結籽率）折損的計算公式如下，以此表示該個體在坐果和結籽水平所受的花粉限制程度。

1.2.4 選擇梯度的估測 選擇梯度用來度量性狀的直接選擇作用強度［26］。參照Lande 等［27］的方法，通過建立目標性狀與個體適合度的回歸模型估測花性狀的選擇梯度，其完整的估測模型［4］如下：

1.3 數據統計分析

人工輔助授粉（處理）和自然授粉（對照）個體的坐果率、單花結籽率以及種子數的差異性均采用廣義線性模型（generalized linear model，GLM）進行分析。采用具有擬二項（quasi-binomial）分布族的廣義線性模型（logistic鏈接函數）分析坐果率與單花結籽率的差異顯著性；采用具有負二項式分布族的廣義線性模型（log 鏈接函數）分析個體適合度（種子數）的差異顯著性。

個體花性狀與其坐果率和結籽率的關系用廣義線性模型（二項分布，logistic 鏈接函數）進行多元回歸分析。模型中，因變量為個體的坐果率或結籽率，自變量為各花性狀值，同時加入“莖粗”作為協變量，以消除母株影響。花性狀與個體坐果率和結籽率折損的線性關系，采用一般線性模型進行分析。分析前，對各模型解釋變量進行標準化處理：（個體性狀值-種群平均值）/標準差，使其平均數為0，方差為1。

性狀選擇梯度用一般線性模型（linear model，LM）通過多元回歸分析進行估測，因變量為個體的相對適合度（個體適合度/種群平均適合度），自變量為標準化的性狀值。根據Lande 等［27］的方法，線性（定向）選擇梯度通過建立簡單線性模型進行估測，即模型中解釋變量只包括各性狀的一次項；非線性選擇和相關選擇梯度通過建立全模型進行分析，模型的解釋變量包括各性狀的一次項、二次項和互作項。本研究中，所有選擇模型均未檢測到顯著的非線性選擇，因此，在結果部分未展示相關數據。最后，對模型中顯著性狀的選擇梯度運用變量添加圖（the added-variable plots）進行回歸診斷。以上所有數據統計均在R 軟件（R 3.5.1）中運行完成，采用Sigmaplot 和Origin 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 毛地黃鼠尾草在不同授粉條件下的繁殖成功

毛地黃鼠尾草個體的坐果率，單花結籽率以及種子數在自然授粉和人工輔助授粉條件下皆存在顯著差異（圖1）。在人工輔助授粉條件下，個體的坐果率與單花結籽率分別為38.61%和0.837，在自然授粉條件下分別為26.20%和0.535，二者在處理與對照間均存在顯著差異（P＜0.001）。在自然授粉條件下，個體的平均種子數為20.48，顯著低于人工輔助授粉條件（32.20，P＜0.001）。

圖1 毛地黃鼠尾草在不同授粉條件下的坐果率、單花結籽率和種子數Fig.1 Fruit set，seed set per flower and seed number of S. digitaloides individuals under different conditions of pollination

2.2 毛地黃鼠尾草個體的繁殖效率及其在花粉限制條件下的折損與花性狀的關系

在不同授粉條件下，毛地黃鼠尾草個體的坐果率和結籽率與花性狀的關系存在明顯的差異（表1）。自然授粉條件下，個體的坐果率和結籽率均與花柱頭高度存在顯著的負相關關系，其偏回歸系數分別為-0.173（P=0.017）與-0.158（P=0.029）；花冠口大小與個體的坐果率顯著正相關（P=0.026），而與結籽率的關系不顯著（P=0.088）。在人工輔助授粉條件下，個體的坐果率和結籽率均與花數量存在顯著的負相關關系，偏回歸系數分別為-0.171（P=0.024）和-0.203（P=0.006）；另外，個體的結籽率與花柱頭探出花冠長度也存在顯著的負相關關系，其偏回歸系數為-0.227（P=0.031）。在自然授粉條件下，該植物因花粉限制導致的結籽率折損與花柱頭探出花冠長度和花數量均存在顯著的負相關關系，其偏回歸系數分別為-0.091（P=0.041）和-0.119（P=0.003）；個體的坐果率折損與花數量之間存在顯著的負相關性，其回歸系數為-0.040（P=0.018）。

表1 毛地黃鼠尾草的坐果率和結籽率及其在花粉限制條件下的折損與花性狀的回歸關系Table 1 The regression relationship of S. digitaloides floral traits with fruit set，seed set，and their discounts resulting from pollen limitation

2.3 不同授粉條件下毛地黃鼠尾草花性狀的選擇

毛地黃鼠尾草的花性狀在自然授粉與人工輔助授粉條件下的選擇存在顯著差異（表2 和圖2）。花數量在自然授粉與人工輔助授粉條件下皆受到顯著的正定向選擇，選擇梯度分別為0.254（圖2B，P＜0.001）和0.120（圖2F，P=0.040）。柱頭高度在自然授粉條件下受到了顯著的定向選擇，其選擇梯度為-0.166（圖2A，P=0.014），而在人工輔助授粉條件下，其選擇梯度不顯著（P=0.093）。相反，柱頭探出花冠長度在人工輔助授粉條件下受到了顯著的負定向選擇，選擇梯度為-0.176（圖2E，P=0.028），而在自然授粉條件下其選擇梯度不顯著。自然授粉條件下，該植物的花冠長和柱頭高度以及冠口大小和柱頭探出花冠長度兩個組合性狀受到了顯著的相關選擇，其選擇強度分別為0.115（圖2C，P=0.025）和-0.119（圖2D，P=0.025）；在人工輔助授粉條件下，對花性狀組合未檢測到顯著的相關選擇。

圖2 毛地黃鼠尾草花性狀在不同授粉條件下顯著的選擇梯度Fig.2 Significant selection gradients for floral traits of S. digitaloides under different pollination conditions

表2 毛地黃鼠尾草種群在不同授粉條件下的花性狀選擇梯度Table 2 Selection gradients for floral traits of S.digitaloides under different pollination conditions

3 討論

在自然種群中，植物的繁殖成功普遍受到花粉限制或資源供給不足的影響［28-29］。表型選擇理論認為，當植物的繁殖存在花粉限制，且種群內不同個體的花粉限制程度存在差異時，傳粉者介導的選擇才能夠發生［5］。本研究結果顯示，人工輔助授粉能顯著提高毛地黃鼠尾草個體的雌性適合度，表明該植物的繁殖存在明顯的花粉限制。另外，在自然授粉條件下，該植物不同個體因花粉限制導致的繁殖效率（即坐果率和結籽率）折損與個體的花數量之間存在顯著的負相關性，說明花數量越大的個體，其花粉限制程度相對越低。相應地，該植物的花數量在自然授粉條件下受到了強烈的定向選擇，通過人工補充授粉后，其選擇強度顯著降低。這一結果表明，在花粉限制條件下，該植物的花產量性狀受到了強烈的傳粉者介導的選擇。許多研究表明，植物的花數量不僅會通過傳粉者受到間接選擇，而且在很大程度上會因為決定植物個體的繁殖交配機會（reproductive capacity for mating opportunities）而受到直接選擇［30-31］。本研究中，該植物的花產量性狀在補充授粉條件下仍檢測到顯著的選擇梯度，在一定程度上反映了花數量通過影響個體的繁殖交配機會所受到的選擇作用。根據Bateman 法則，植物在授粉充足時，其雌性適合度（種子生產）主要受資源限制的影響［32］。本研究中，毛地黃鼠尾草在輔助授粉條件下的坐果率和結籽率與個體的花數量之間皆存在顯著的負相關關系，表明在授粉充足時該植物個體的花產量與種子生產之間存在明顯的資源權衡（trade-off）。因此，其花產量性狀選擇隨傳粉環境變化會受到不同程度的資源限制影響［29］。

在開花植物與昆蟲的傳粉互作系統中，花部結構性狀會通過與傳粉者的機械互作（mechanical interaction）影響植物的傳粉效率和繁殖成功，因而會受到傳粉者介導的自然選擇［33-34］。有學者認為，鼠尾草屬植物精巧的杠桿式背部傳粉機制，其花部結構（或昆蟲體型）的任何微小改變會對其傳粉效率產生顯著影響，因此花性狀會受到強烈的傳粉者選擇［35］。本研究結果顯示，在自然授粉條件下，毛地黃鼠尾草不同個體的繁殖效率與其花柱頭高度顯著負相關，即柱頭位置較低的個體具有相對的適合度（或選擇）優勢；同時，該性狀受到了顯著的負定向選擇作用。然而，在人工補充授粉條件下，該植物的繁殖效率與花柱頭高度之間不存在顯著的相關關系，同時也未檢測到顯著的選擇梯度。這一結果表明，在自然授粉條件下，該植物的花柱頭高度會顯著影響個體的傳粉效率和繁殖成功，從而受到傳粉者介導的選擇。Zhang 等［17］通過對該物種另一種群的花表型選擇研究發現，該植物的花柱頭高度未受到顯著的選擇作用，這可能是由傳粉者類群及其與花結構互作在不同種群的變異性所引起［11］。

在鼠尾草屬植物的花部結構性狀中，花柱探出花冠長度決定著柱頭的相對位置，是易受傳粉者選擇的另一關鍵性狀［17］。本研究中，該植物的柱頭探出花冠長度在自然授粉（花粉限制）條件下未受到顯著的選擇作用；相反，在補充授粉條件下，該性狀受到了顯著的負定向選擇作用。換言之，在傳粉不足的條件下，該植物柱頭探出花冠長度的變異性并未導致不同個體間顯著的雌性適合度差異；但是，在花粉供給充足時，該性狀變異會顯著影響其雌性適合度，柱頭探出花冠外越長越不利于個體的繁殖成功。這一結果說明，該性狀在當前種群并未通過與傳粉者互作而受到顯著選擇。考慮到高海拔地區植物繁殖環境（如氣候條件）的多變性，該植物在不存在花粉限制時，短花柱個體較長花柱個體具有適合度優勢，可能是因為長花柱延長了花粉管生長發育時間，提高了植株個體授粉到受精的繁殖風險，因而會影響其繁殖成功；相反，較短的花柱能大大縮短授粉至受精的時間，有利于提高個體的繁殖成功率。因此，在自然授粉（花粉限制）條件下，即便長花柱個體具有相對的傳粉優勢，其傳粉者對該性狀的選擇作用也會因為長花柱帶來的負效應而抵消。因此，在該植物種群，花柱探出花冠長度可能同時受傳粉者和氣候因子選擇的影響［2，36］。

當植物的兩個性狀通過互作影響個體的繁殖適合度時，該性狀組合（trait combination）將受到相關選擇作用（correlational selection）［26］。開花植物花性狀的相關選擇可導致花表型及其功能的整合［37］。本研究中，盡管毛地黃鼠尾草的花冠長與柱頭高度的組合性狀檢測到了顯著的相關選擇梯度，但是其變量添加結果顯示，該性狀組合未表現出明顯的相關選擇趨勢。另外，花冠口大小與柱頭探出花冠長度受到了顯著的負相關選擇作用，表明花冠口較小、柱頭探出花冠外較長的個體以及花冠口較大、柱頭探出花冠外較短的個體均具有適合度優勢。這種相關選擇作用，很可能反映了該植物的花對不同大小傳粉者類群的分化適應。因為小體型傳粉者容易為花冠口較小、柱頭探出花冠較長的花進行傳粉；然而，大體型傳粉者適宜為花冠口較大、柱頭探出花冠較短的花進行傳粉。同樣，Zhang 等［17］在該物種的另一種群發現，該植物的花冠口高度與柱頭探出花冠長度受到了顯著的相關選擇，而且該性狀組合為了適應不同大小傳粉者類群的年度變異表現出不同的選擇模式。類似地，Zhang 等［25］研究發現，同屬的雌-全花異株（gynodioecious）植物草地鼠尾草（Salvia pratensis）的花性狀對種群內不同大小的傳粉者類群表現出性別特異的適應性。

4 結論

毛地黃鼠尾草的繁殖成功在該自然種群存在明顯的花粉限制，其花產量性狀既可通過傳粉者介導受到定向選擇，也可直接影響個體的繁殖交配機會而受到選擇。花部結構性狀中，花柱頭高度對個體的繁殖效率及適合度有顯著影響，其選擇作用主要通過傳粉者介導而發生；花柱頭探出花冠長度會影響個體的受精成功率，其選擇作用主要受花粉萌發和受精環境（如氣候因子）的影響；花冠大小與柱頭位置相關性狀的組合受到顯著的相關選擇作用。總體表明，毛地黃鼠尾草的花性狀受到顯著的傳粉者介導選擇；其中，花部結構性狀為提高傳粉效率表現出明顯的功能整合趨向。