精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃發酵和菌群結構的影響

戴東文 ，龐凱悅 ，王迅 ，楊英魁 ，柴沙駝 *，王書祥 *

（1. 青海大學畜牧獸醫科學院，青海 西寧 810016；2. 青海省高原放牧家畜營養與飼料科學重點實驗室，青海 西寧 810016；3. 青海省牦牛工程技術研究中心，青海 西寧 810016）

牦牛主要棲息在青藏高原及周圍地區，是青藏高原的優勢畜種，也是當地牧民重要的生產生活資料［1］。由于青藏高原獨特的地理環境，一年只有“冷季”與“暖季”之分，與冷季相比，暖季牧草產量與營養成分雖然有所提高，但是仍不能滿足牦牛高效生產的需要，傳統放牧條件下生長效率較低［2-3］。瘤胃是反芻動物消化日糧的重要場所，其含有豐富的細菌、真菌、原蟲等微生物。瘤胃微生物在蛋白質、碳水化合物和淀粉等營養物質消化中發揮重要作用，通過厭氧發酵產生揮發性脂肪酸和微生物蛋白，為宿主提供能量和蛋白質［4-5］。影響反芻動物發酵的因素有很多，其中飼糧精料水平是其中一個重要的因素。楊碩等［6］研究發現，補飼精料降低了大青山絨山羊瘤胃內與纖維分解相關細菌的豐度，而提高了產甲烷菌豐度。有研究表明，隨著精料水平的提高，奶牛瘤胃中纖維降解菌的生長受到抑制，而產酸菌的豐度增加［7］。因此，適宜的精料補飼水平能夠優化反芻動物瘤胃微生物區系，提高飼料利用率及動物的生產性能。本課題前期研究了精料水平對暖季放牧牦牛生長的影響，結果發現，暖季放牧牦牛飼喂較高精料水平時可獲得較好的生長性能和養殖收益［8］，這可能與不同精料補飼水平影響了牦牛瘤胃菌群組成與結構有關，因此，本試驗通過16s rDNA 高通量測序技術來探討不同精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃菌群的影響，以期為青藏高原暖季放牧牦牛精準補飼提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設計

試驗于2019年7-9月在青海省貴南縣老扎西牧場進行，該草場屬于高寒草甸草地，優勢種有小嵩草（Kobresia humilis）、高山嵩草（Kobresia pygmaea）、矮嵩草（Kobresia humilis）、線葉嵩草（Kobresia capillifolia）等。選取健康、體況良好和體重相近（123.96±7.43）kg 的公牦牛48 頭，隨機分為4 組（每組12 頭）：對照組（放牧）、補飼組每頭分別補飼0.5（Ⅰ）、1.5（Ⅱ）和2.5 kg·d-1（Ⅲ）精料。試驗期為70 d，其中預試期10 d，正式期60 d。

1.2 飼養管理與日糧成分

所有試驗牦牛在同一草場放牧，設置4個面積大小一樣的圍欄小區，8：00 出牧，18：00 收牧，3個補飼組在出牧前和收牧后分兩次進行補飼，所有試驗牦牛自由飲水。補飼精料參照肉牛飼養標準（NY/T815-2004），結合放牧牦牛采食量配制［9］。牧草營養水平、精料組成以及精料營養水平見表1。

表1 牧草營養水平、精料組成以及精料營養水平（干物質基礎）Table 1 Nutrient level of the pasture，ingredient and nutrient level of the concentrate supplement（DM basis）（%）

1.3 瘤胃液的采集

正式試驗第60 天，晨飼前采用胃管式采樣器（GCYQ-1-A，武漢市科立博器材有限公司）采集瘤胃液150 mL，4 層紗布過濾后立即測定pH 值，剩余瘤胃液樣品分裝至15 mL 離心管中，立即儲存到液氮中，帶回實驗室備用。

1.4 指標測定與方法

1.4.1 瘤胃發酵參數的測定 pH：使用臺式酸度計（HANNA HI221，北京菁美瑞科技有限公司）測定瘤胃液pH，測定前對該酸度計使用相應標準液進行校正；參照馮宗慈等［10］改進的比色法測定瘤胃液氨態氮（NH3-N）濃度，儀器為紫外可見分光光度計（TU-1810，北京普析通用儀器有限公司），預熱30 min，在波長625 nm 處測定溶液吸光度（optical density，OD）值，利用標準曲線測定樣品的NH3-N 濃度；采用考馬斯亮藍法［11］在595 nm 波長處比色測定微生物蛋白（microprotein，MCP）濃度（A045-2，試劑盒購于南京建成生物工程研究所）；使用日本島津GC-2014 型氣相色譜儀測定揮發性脂肪酸（volatile fatty acids，VFA）濃度［12-13］。

其中VFA 濃度測定條件為：氫火焰離子檢測器（FID，日本島津有限公司），色譜柱為毛細管柱（FFAP，30.00 m×0.32 mm×0.50 μm）；升溫條件為，初始 60 ℃，以 10 ℃·min-1升溫至 120 ℃，保留 2 min，以 15 ℃·min-1升溫至 180 ℃，保留 5 min，汽化室溫度 250 ℃；FID 溫度 250 ℃；進樣量 1 μL，載氣為高純氮氣（99.99%），壓力0.7 MPa；氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa，毛細管柱壓力0.6～0.8 MPa，分流比 40∶1。

1.4.2 瘤胃微生物DNA 提取、測序 每組隨機選擇4 頭牛的瘤胃液樣品置于冰上解凍并充分混合，參考Denman 等［14］的CTAB 方法提取瘤胃樣品基因組DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和濃度，取適量的樣本于離心管中，用無菌水稀釋樣本至1 ng·μL-1。根據細菌16S rDNA 基因的V3～V4 區，合成帶有Barcode 的特異引物。通用引物序列 515F：5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′，806R：5′-GGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′。PCR 采用 25 μL 擴增體系；DNA 模板 5 ng，5 μmol·L-1的上、下游引物各 1 μL，2 ng·μL-1的牛血清白蛋白（BSA）3 μL，2×Taq Plus Master Mix 12.5 μL，雙蒸水（ddH2O）補加至 25 μL；PCR 擴增條件：94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 30 s，50 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，共 30個循環；72 ℃延伸 7 min。PCR 擴增產物用 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用QIAquickPCR 純化試劑盒（Qiagen，德國）純化回收，符合要求的DNA 樣品送至北京奧維森基因科技有限公司測序，測序平臺為Mixed PE 300。

1.4.3 數據分析 測序平臺得到的原始數據使用Trimmomatic（Version 0.36）軟件去除低質量數據，然后通過vsearch 軟件和物種數據庫去除嵌合體，得到有效序列。篩選相似性在97%以上的序列生成OTUs，然后對OTU 聚類、物種分類學、多樣性指數、群落結構進行統計分析。

1.5 數據統計與分析

試驗數據用Excel 2016 初步整理后，采用SPSS 24.0 進行單因素ANOVA 模型方差分析，并用Duncan 氏法進行組間的多重比較，通過正交多項式比較精料補飼水平的線性和二次效應，P＜0.05 表示差異顯著，結果均以平均值和標準誤（standard error of mean，SEM）表示。

2 結果與分析

2.1 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃發酵參數的影響

由表2 可知，隨著精料補飼的提高，牦牛瘤胃液pH、乙酸濃度和乙酸/丙酸值呈線性和二次降低（P＜0.05）；補飼Ⅱ和Ⅲ組的微生物蛋白濃度顯著高于其他兩組（P＜0.05）；瘤胃總揮發性脂肪酸（total volatile fatty acids，TVFA）、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸濃度隨精料補飼水平的提高呈線性和二次提高（P＜0.05）。結果表明，適當提高精料補飼水平，促進了暖季牦牛瘤胃發酵。

表2 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃發酵參數的影響Table 2 Effect of different concentrate supplement levels on rumen fermentation parameters of grazing yaks in the warm season

2.2 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌豐富度與多樣性的影響

由圖 1 可知，4 組共產生 3138個 OTU，其中對照組、補飼Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ組分別產生 2482、2285、2252 和 2014個OTU；相 對 應 的 獨 有 OTU 數 目 分 別 為 183、169、90、106個，共 有 OTU 數目為 1337個 ，占 總 OTU 數 目 的42.61%。由圖2 可知，隨著測序深度的增加，4 組瘤胃細菌稀釋曲線趨于平緩，說明測序程度已基本覆蓋到樣品中所有的細菌物種。通過α 多樣性分析（表3）可知，隨著精料補飼水平的提高，牦牛瘤胃液細菌的物種數、Chao1指數和香農（Shannon）指數呈線性和二次降低（P＜0.05），細菌覆蓋率在各組間無顯著差異（P＞0.05）。通過PCoA（圖3）分析可知，不同精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌群落結構的影響差異明顯，其中補飼Ⅱ和Ⅲ組細菌結構較為接近。以上結果表明，精料補飼水平能顯著影響暖季放牧牦牛瘤胃細菌的多樣性，精料補飼水平越高，瘤胃細菌豐富度與多樣性越低。

圖3 PCoA 分析Fig.3 Analysis by principal co-ordinate analysis

表3 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌Alpha 多樣性的影響Table 3 Effect of different concentrate supplement levels on alpha diversity of rumen bacteria of grazing yaks in the warm season

圖1 OTU 韋恩圖Fig.1 OTU venn diagram

圖2 瘤胃細菌稀釋曲線Fig.2 Sparse curve of ruminal bacteria

2.3 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌組成的影響

由表4 可知，在門水平上，隨著精料補飼水平的提高，瘤胃擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度呈線性和二次提高（P＜0.05）；而厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度隨精料補飼水平提高呈線性和二次降低（P＜0.05）；放線菌門（Actinobacteria）相對豐度隨精料補飼水平的提高呈線性提高（P＜0.05）；其他菌門組間無顯著差異（P＞0.05）。由表5 可知，在屬水平上，隨著精料補飼水平的提高，瘤胃普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）及普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相對豐度呈線性和二次提高（P＜0. 05）；而解琥珀酸菌屬（Succiniclasticum）和瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）相對豐度隨著精料補飼水平的提高呈線性和二次降低（P＜0.05）。以上結果表明，精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌結構有一定的影響。

表4 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌組成門水平的影響Table 4 Effect of different concentrate supplement phylum levels on the microbe composition of grazing yaks in the warm season（%）

表5 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌組成屬水平的影響Table 5 Effect of different concentrate supplement genus levels on the microbe composition of grazing yaks in the warm season（%）

3 討論

3.1 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃發酵參數的影響

瘤胃揮發性脂肪酸（VFA）是反芻動物發酵日糧的產物，是機體的主要功能物質，也是反映瘤胃發酵功能的重要指標，其包括乙酸、丙酸和丁酸等短鏈脂肪酸。陳志龍等［15］研究發現，提高飼糧精粗比能顯著降低綿羊瘤胃液pH 值。本研究結果表明，提高精料補飼水平，瘤胃液pH 值呈下降趨勢，且補飼Ⅱ和Ⅲ組瘤胃液pH 值顯著低于對照組，結果與其相一致。這可能是隨著精料補飼水平的提高，牦牛攝入的非結構性碳水化合物的含量也上升，發酵后產生大量的VFA 和乳酸等物質，導致瘤胃液pH 值下降。瘤胃氨態氮（NH3-N）是瘤胃微生物利用飼料中的蛋白質合成的，也是瘤胃微生物蛋白（MCP）合成的前體，其濃度反映了瘤胃微生物分解含氮物質產生NH3-N 的速度及對其的攝取利用情況。本試驗中，NH3-N 濃度隨著精料補飼水平的提高而下降，而瘤胃液MCP 濃度上升，這與張瑩瑩等［16］和丁靜美等［17］的研究結果一致。可能原因是瘤胃微生物快速發酵非結構性碳水化合物從中獲得充足的能量，促進了微生物利用NH3-N 合成MCP 的速度，從而降低了瘤胃NH3-N 濃度。李嵐捷等［18］研究發現，隨著飼糧NFC/NDF 水平的提高，犢牛瘤胃丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 濃度顯著增加，而乙酸濃度和乙酸/丙酸值顯著降低。占今舜等［19］研究也發現，提高飼糧精粗比，提高了湖羊瘤胃丙酸、丁酸、戊酸和TVFA 濃度。本研究中，隨著精料補飼水平的提高，牦牛瘤胃丙酸、丁酸和TVFA 濃度顯著增加，而乙酸濃度和乙酸/丙酸顯著降低，與以上研究結果相一致。丙酸是反芻動物體內主要的生糖前體，促進丙酸的生成對提高反芻動物生長性能具有重要的現實意義，因此適當提高暖季放牧牦牛的精料補飼水平能夠提高瘤胃菌體蛋白與丙酸濃度，進而提高牦牛的生長性能，前期的研究中補飼Ⅲ組的平均日增重最高達到834.00 g［8］也驗證了這一結果。

3.2 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌豐富度與多樣性的影響

16s rDNA 高通量測序技術可以快速，高效地了解瘤胃微生物菌群的結構與種類，因此通過該技術能夠全面了解精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃菌群的影響。Chao1 指數通常用來表示菌群豐富度指標，其值越大表明菌群豐富度越大；香農（Shannon）指數是衡量菌群多樣性的指標，其值越大表明菌群多樣性越高。周力等［20］研究發現，補飼精料降低了藏羔羊瘤胃細菌多樣性與豐富度。Liu 等［21］研究也發現，提高飼糧中精料比例，顯著降低了牦牛瘤胃細菌Chao1 和Shannon 指數。本研究中，隨著精料補飼水平的提高，牦牛瘤胃細菌OTU 數目和Alpha 多樣性指數下降，與以上研究結果相一致。

3.3 精料補飼水平對暖季放牧牦牛瘤胃細菌組成的影響

飼糧組成是影響反芻動物瘤胃微生物的主要因素之一，飼糧精料水平會直接影響瘤胃微生物的組成與數目。有研究表明，擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes）是反芻動物的優勢菌門，擬桿菌門是降解碳水化合物的主要細菌，而厚壁菌門主要參與纖維物質的分解，兩者在瘤胃發酵過程起著至關重要的作用［22-23］。本研究也得到相似的結果。林波等［24］用0∶100、35∶65 和50∶50 三種精粗比飼糧飼喂泌乳期水牛時發現，全粗料組瘤胃細菌擬桿菌門的豐度顯著低于其他兩組，而厚壁菌門的豐度顯著高于其他兩組。本研究中，隨著精料補飼水平的提高，牦牛瘤胃細菌擬桿菌門的豐度隨著上升，而厚壁菌門豐度隨著下降，與以上結果相似，說明補飼提高了牦牛瘤胃中非纖維降解菌的生長增殖。放線菌門（Actinobacteria）是一類革蘭氏陽性菌，具有分支的纖維和孢子，其大部分是腐生菌，也有寄生菌，可致病［25］。本研究中，提高精料補飼水平能夠提高牦牛瘤胃放線菌門的豐度，表明生產中牦牛要適度補飼。

在屬水平上，普雷沃氏菌是反芻動物瘤胃廣泛存在的菌屬，隸屬擬桿菌門，參與瘤胃內的多種代謝活動，主要降解日糧中的半纖維成分，具有高活性的半纖維降解功能，并且普雷沃氏菌產生大量的復合酶，促進非纖維性多糖和蛋白質的降解［26］。本研究中，牦牛瘤胃優勢菌屬為普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）和理研菌科_RC9（Gikenellaceae_RC9），這與張林［27］的研究結果相一致，與肖潤等［28］的研究不太一致。可能是動物品種、生理階段、飼糧結構和年齡不同等導致。高雨飛［11］研究發現，高精組錦江牛瘤胃普雷沃菌屬的豐度顯著高于粗料組，本研究結果與其基本一致，即隨著精料補飼水平的提高，牦牛瘤胃中普雷沃菌屬_1 和普雷沃氏菌科_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）的豐度隨著上升。克里斯滕森菌科屬于厚壁菌門，對維持胃腸道結構、功能和動物機體免疫調節有著重要作用［29］。本研究中，瘤胃克里斯滕森菌科_R-7（Christensenellaceae_R-7）的豐度隨著精料補飼水平的提高呈增加的趨勢，且補飼Ⅲ組顯著高于放牧組，說明適宜的精料補飼水平有助于提高暖季放牧牦牛的免疫力。有研究報道，解琥珀酸菌（Succiniclasticum）豐度與飼糧纖維成分有密切聯系，可以降解纖維或纖維二糖產生琥珀酸和乙酸等物質［30］。本研究中，補飼顯著降低了牦牛瘤胃中解琥珀酸菌的豐度，可能原因是補飼提高了牦牛非纖維物質的攝入量，增加了非纖維性多糖和蛋白質的攝入量，進而導致瘤胃中解琥珀酸菌豐度下降。瘤胃球菌屬主要包括黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，能夠產生大量的纖維素酶，是主要的纖維分解菌［31］。張雪嬌等［32］研究發現，山羊瘤胃中瘤胃球菌科_UCG-005（Ruminococcaceae_UCG-005）的豐度隨著飼糧NDF 水平提高而升高，本研究結果與其相似，說明提高精料補飼水平抑制了纖維降解菌的生長。

4 結論

在本試驗條件下，精料補飼水平為2.5 kg·d-1時能促進暖季放牧牦牛瘤胃發酵，降低細菌豐富度與多樣性；提高瘤胃擬桿菌門和放線菌門的豐度，但降低厚壁菌門的豐度；提高普雷沃菌屬_1、克里斯滕森菌科_R-7 和普雷沃氏菌科_UCG-001 的豐度，但會降低解琥珀酸菌屬的豐度。結果表明，適宜提高精料補飼水平能夠促進暖季放牧牦牛瘤胃發酵，提高瘤胃部分淀粉降解菌的豐度，進而提高其生長性能。