多年生黑麥草細(xì)胞分裂素信號(hào)通路B 類ARR轉(zhuǎn)錄因子LpARR10 的耐鎘功能分析

張晴，邢靜，姚佳明，殷庭超，黃心如，何悅，張敬，徐彬

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，江蘇 南京 210095）

隨著工業(yè)的不斷進(jìn)步，重金屬資源的需求也日益增加，而重金屬礦產(chǎn)資源的大量開(kāi)采會(huì)導(dǎo)致礦區(qū)土地和水體遭受不同程度污染，其中重金屬鎘（Cd）是污染最為嚴(yán)重及生物毒性最強(qiáng)的元素之一［1］。近幾年，隨著《美麗鄉(xiāng)村建設(shè)》和《山水林田湖草生態(tài)保護(hù)修復(fù)工程指南（試行）》政策的推行［2］，重金屬礦區(qū)及周邊的土壤治理、植被恢復(fù)及園林綠化顯得至關(guān)重要。草類是重金屬修復(fù)的理想材料，不僅能吸收土壤重金屬元素，還具有環(huán)境美化作用。因此，挖掘草類耐鎘基因資源，并通過(guò)分子育種手段培育耐鎘新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

植物的耐逆反應(yīng)受細(xì)胞分裂素、乙烯、脫落酸和茉莉酸等內(nèi)源激素的調(diào)控［3］。細(xì)胞分裂素在植物耐逆反應(yīng)中起到正調(diào)控作用，已有很多研究表明外源或內(nèi)源增加（過(guò)量表達(dá)細(xì)胞分裂素合成基因ipt）能夠有效提高植物的耐高溫、干旱和高鹽等能力［4-6］。近年來(lái)，有研究表明外源細(xì)胞分裂素處理也能夠緩解重金屬鎘對(duì)植物造成的損傷［7-8］。例如，在鎘脅迫下，外部噴施6-BA 提高了玉米（Zea mays）幼苗體內(nèi)葉綠素和脯氨酸的含量，促進(jìn)了葉片過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性的升高，并增加了玉米幼苗生物量［7］。另外，Gemrotová 等［8］的研究結(jié)果表明，在鎘脅迫條件下，細(xì)胞分裂素拮抗劑PI-55 和細(xì)胞分裂素降解抑制劑INCYDE［2-chloro-6-（3-methoxyphenyl）aminopurine］處理對(duì)藥用鱗芹屬（Bulbine）植物幼苗的芽和根生長(zhǎng)均具有顯著影響，其中INCYDE 處理顯著提高了其芽和根的生長(zhǎng)。上述研究結(jié)果表明細(xì)胞分裂素有助于保護(hù)植物免受高Cd脅迫帶來(lái)的損傷。然而，細(xì)胞分裂素調(diào)控植物耐鎘的生理生化途徑尚不清楚。細(xì)胞分裂素下游Arabidopsis Response Regulator（ARR）家族轉(zhuǎn)錄因子是調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)［9］。根據(jù)核心功能域的相識(shí)度和 C 端功能域的長(zhǎng)度，ARRs 可劃分為兩類，即 A 類和 B 類 ARRs［10-11］。B 類 ARRs 具有轉(zhuǎn)錄激活活性，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮正調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的功能［12-13］。有研究證明，B 類ARRs 能夠延緩擬南芥（Arabidopsis thaliana）的衰老，并提高其耐逆性［14-15］。因此，本研究推測(cè)細(xì)胞分裂素可能通過(guò)其信號(hào)傳導(dǎo)通路B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮調(diào)控耐鎘的分子功能。

多年生黑麥草（Lolium perenne）是重要的早熟禾亞科冷季型草，具有牧草和草坪草兩種生態(tài)型，在我國(guó)長(zhǎng)江流域及以南的丘陵地區(qū)和人工草地中廣泛種植［16］。多年生黑麥草的耐重金屬鎘的能力弱，限制了其在礦區(qū)土壤修復(fù)的利用。因此，培育耐鎘黑麥草新品種具有重要意義。本試驗(yàn)以多年生黑麥草為研究材料，從已發(fā)表的多年生黑麥草轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出5個(gè)受逆境誘導(dǎo)的ARR 轉(zhuǎn)錄因子，其中LpARR10受鎘誘導(dǎo)表達(dá)。因此，該研究擬通過(guò)分析LpARR10 的進(jìn)化關(guān)系及功能域，探究LpARR10基因在鎘逆境條件下的表達(dá)模式，評(píng)價(jià)LpARR10過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的耐鎘能力，以明確LpARR10基因的調(diào)控耐鎘性的功能及途徑。研究結(jié)果有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)植物的耐鎘機(jī)制，并為培育耐鎘性強(qiáng)的黑麥草新品種提供基因資源。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2018年9月-2020年7月在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院草類生理生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1 LpARR10 功能域、進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)分析

從本研究團(tuán)隊(duì)已發(fā)表的多年生黑麥草全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)（SRA 號(hào)：PRJNA335527）［17］中獲取LpARR10編碼區(qū)序列（coding sequence，CDS），采用NCBI-blastn 在線軟件預(yù)測(cè)其蛋白功能域。從Tair 網(wǎng)站獲取擬南芥A 類和B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子序列，利用MEGA 6.0 軟件繪制LpARR10 和擬南芥A 類和B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子的遺傳進(jìn)化圖。根據(jù)LpARR10的CDS 設(shè)計(jì)基因全長(zhǎng)引物（表1），以多年生黑麥草（品種：Buena Vista）的gDNA 為模版，克隆并測(cè)定LpARR10的基因序列。根據(jù)其CDS 和基因組序列，利用BioXM 軟件預(yù)測(cè)其外顯子和內(nèi)含子等基因結(jié)構(gòu)。

1.2 LpARR10 基因的表達(dá)分析

多年生黑麥草種子播于陶粒土中，放置于智能人工氣候室（夜間20 ℃，10 h；白天25 ℃，14 h；光強(qiáng)為750 mmol·m-2·s-1）。每 3 d 澆灌一次 1/2 霍格蘭氏（Hoagland’s）營(yíng)養(yǎng)液［18］，待種子萌發(fā) 14 d 后挑取生長(zhǎng)情況一致的幼苗水培于 Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液中，預(yù)培養(yǎng) 2 周后用 25 μmol·L-16-BA 和 200 μmol·L-1CdCl2處理其根部［19］，并在0、0.5、2、6、12、24 和 48 h 后取根和葉片樣品，凍存于-80 ℃冰箱，每個(gè)處理有 4個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采用 Plant RNA Kit（Omega Bio-Tec，美國(guó)）提取樣品的 mRNA，利用 Takara cDNA synthesis kit（含基因組 DNA 酶）將 mRNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用羅氏熒光定量系統(tǒng)（Roche Light Cycler?480-Ⅱ）測(cè)定目的基因的相對(duì)表達(dá)量，目的基因及內(nèi)參基因LpeLF4A的引物序列見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 載體構(gòu)建及擬南芥的遺傳轉(zhuǎn)化

以多年生黑麥草cDNA 為模版，采用NEB Q5 高保真酶克隆LpARR10編碼區(qū)序列，經(jīng)雙酶切連接到入門載體 pEND-linker，利用 LR 反應(yīng)（Gateway LR Enzyme Mix）將測(cè)序正確的 pEND-LpARR10與 pEarleygate-103 過(guò)量表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得35S∶∶LpARR10-GFP表達(dá)組件，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中（AGL1菌株）。采用 LB 液體培養(yǎng)基（10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1氯化鈉，pH=7.4）將含有過(guò)量表達(dá)載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)至OD600約為1.0，離心后棄掉LB 培養(yǎng)基，用5%的蔗糖溶液（含有0.02% Silwet L-77）懸浮菌液，暗培養(yǎng)2 h 后侵染野生型擬南芥“Columbia”的花序［20］。一周后再次侵染花序，以提高轉(zhuǎn)基因成功率。收取T0代種子，利用20%的84 消毒液浸泡消毒20 min，無(wú)菌水沖洗4 次，用0.2%的瓊脂糖溶液將種子鋪于含有20 μmol·L-1草銨膦（Basta）的 1/2 MS 培養(yǎng)基（主要成分為 650 mg·L-1NH4NO3，1.9 g·L-1KNO3，440 mg·L-1CaCl2·2H2O，370 mg·L-1MgSO4·7H2O，700 mg·L-1KH2PO4）上，培養(yǎng)一周后，篩選出抗性轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)載體抗草銨膦基因（Bar）設(shè)計(jì)常規(guī)PCR 引物，以抗性轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA 為模版，利用2×PCR 預(yù)混液（Takara）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)抗性轉(zhuǎn)基因株系基因組DNA 中是否有Bar基因，以篩選和鑒定陽(yáng)性LpARR10過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系。獲得穩(wěn)定遺傳的T3代陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系，每個(gè)株系選取4 棵，分別提取葉片的總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，用擬南芥TUBULIN4基因?yàn)閮?nèi)參基因進(jìn)行定量PCR 反應(yīng)，檢測(cè)各轉(zhuǎn)基因株系中LpARR10基因的表達(dá)。

1.4 轉(zhuǎn)基因擬南芥的耐鎘性分析

擬南芥野生型（wild type，WT）和T3代轉(zhuǎn)基因株系種子用20%的84 消毒液浸泡消毒20 min，無(wú)菌水沖洗4次，用0.2%低熔點(diǎn)瓊脂糖將種子鋪于1/2 MS 和加有180 μmol·L-1CdCl2的1/2 MS 培養(yǎng)基中，4 ℃黑暗春化48 h，豎直放置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，10 d 后觀察植株表型并統(tǒng)計(jì)根長(zhǎng)和鮮重指標(biāo)。本試驗(yàn)對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型擬南芥進(jìn)行Cd 處理的濃度（180 μmol·L-1）為預(yù)試驗(yàn)篩選得到。該試驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次，單次試驗(yàn)每個(gè)株系至少種植4 皿用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析（4個(gè)生物學(xué)重復(fù)）。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 23.0 進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算、統(tǒng)計(jì)和差異顯著性分析（P＜0.05），數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差的形式呈現(xiàn)。利用SigmaPlot 12.5、MEGA 6.0 和Excel 2013 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 LpARR10 是 B 類 ARR 轉(zhuǎn) 錄因子

進(jìn)化分析表明LpARR10 與擬南芥B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子聚為一組，且與AtARR10 和AtARR12 親緣關(guān)系較近（圖1），說(shuō)明LpARR10 為B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子。LpARR10具有6個(gè)外顯子，編碼598個(gè)氨基酸（基因登錄號(hào)為ALT32069.1，圖2a）。LpARR10 的氨基酸序列與模式植物大麥（Hordeum vulgare）、擬南芥、水稻（Oryza sativa）和高粱（Sorghum bicolor）同源ARR 轉(zhuǎn)錄因子的相似度較高，且與大麥HvARR12 的同源性最高（圖2b）。氨基酸序列分析表明LpARR10 具B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子特異的磷酸受體結(jié)構(gòu)域（phosphoaccepter receiver domin of type B Arabidopsis response regulators，REC domain of B-type ARRs）、金屬及磷酸化結(jié)合位點(diǎn)和YXXK 功能域（active site）（圖 2b）。

圖1 LpARR10 與擬南芥ARR 轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of LpARR10 and Arabidopsis ARR transcription factors

圖2 LpARR10 的基因組結(jié)構(gòu)及其同源基因的氨基酸序列和功能域分析Fig.2 Genetic structure，amino acid sequence and function domain analysis of LpARR10 and its homologus genes

2.2 LpARR10 受細(xì)胞分裂素和Cd 誘導(dǎo)表達(dá)

LpARR10在多年生黑麥草根和葉片中均表達(dá)，因此，本研究分別測(cè)定了LpARR10在葉片和根中的表達(dá)變化。與處理前相比，細(xì)胞分裂素處理2 和6 h 后葉片中LpARR10的表達(dá)量顯著升高，然而，在處理0.5、12、24 和48 h 后沒(méi)有顯著變化（圖3a）。在根部，細(xì)胞分裂素處理均顯著提高了LpARR10的表達(dá)量，其中在處理6 h 時(shí)表達(dá)量最高，是處理前的17.48 倍，說(shuō)明根部對(duì)細(xì)胞分裂素處理更加敏感（圖3b）。

圖3 外源細(xì)胞分裂素處理下多年生黑麥草葉片和根中LpARR10 基因表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of LpARR10 gene in perennial ryegrass leaves and roots treated with cytokinin

在葉片中，在鎘處理2 和6 h 后，LpARR10基因的表達(dá)量顯著升高，分別為處理前的1.41 和1.37 倍，隨后表達(dá)量下降，而在 12、24 和 48 h 時(shí)與 0 h 無(wú)顯著差異（圖 4a）。在根中，Cd 處理 0.5 h 后即顯著地提高了LpARR10基因的表達(dá)量，并在處理24 h 后，LpARR10的表達(dá)量達(dá)到峰值，其中12、24 和48 h 的基因表達(dá)量分別為處理0 h 時(shí)的3.85、9.53 和5.92 倍（圖4b）。LpARR10的表達(dá)對(duì)鎘和細(xì)胞分裂素的響應(yīng)模式相似，在處理后期，表達(dá)量在根部增加的倍數(shù)明顯高于葉部。

圖4 鎘處理下多年生黑麥草葉片和根中LpARR10 基因表達(dá)Fig.4 LpARR10 gene expression in leaves and roots of perennial ryegrass under cadmium treatment

2.3 LpARR10 過(guò)量表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的鑒定

收取T0代種子，經(jīng)草銨膦（Basta）抗性篩選，共得到3個(gè)抗性轉(zhuǎn)基因株系（圖5）。根據(jù)抗除草劑Bar基因設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行PCR 檢測(cè)，野生型擬南芥沒(méi)有檢測(cè)出目的基因條帶，而轉(zhuǎn)基因植株均檢測(cè)出目標(biāo)條帶（圖5a），且T3代轉(zhuǎn)基因株系的種子均能在草銨膦篩選板上萌發(fā)（圖5b），說(shuō)明3個(gè)株系的T3代均為純合轉(zhuǎn)基因植株。進(jìn)一步采用定量PCR 方法檢測(cè)野生型和轉(zhuǎn)基因株系中黑麥草LpARR10基因的表達(dá)量，結(jié)果表明LpARR10在3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中均表達(dá)（圖5c）。

圖5 LpARR10 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株系的鑒定Fig.5 Identification of LpARR10 overexpression transgenic lines

2.4 過(guò)量表達(dá)LpARR10 提高了擬南芥耐鎘能力

在無(wú)鎘處理的條件下（1/2 MS 培養(yǎng)基），野生型與轉(zhuǎn)基因株系的生長(zhǎng)狀況無(wú)明顯差異（圖6）。當(dāng)處于180 μmol·L-1Cd 脅迫時(shí)，擬南芥植株葉片變黃，地上部和根系生長(zhǎng)受到抑制。在野生型擬南芥中，Cd 處理使得根長(zhǎng)和地上部鮮重分別降低了88.47%和72.82%。然而，在Cd 處理?xiàng)l件下，3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的根長(zhǎng)和地上部鮮重均顯著高于野生型對(duì)照，說(shuō)明LpARR10基因正調(diào)控?cái)M南芥耐鎘功能。盡管3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中目標(biāo)基因LpARR10的表達(dá)量有顯著差異，但在正常和鎘處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)基因株系之間的表型沒(méi)有顯著差異。

圖6 鎘處理?xiàng)l件下轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥鮮重和根長(zhǎng)Fig.6 Fresh weight and root length in transgenic lines and wild type Arabidopsis when treated with Cd

3 討論

土壤是植物根部生長(zhǎng)發(fā)育的環(huán)境，為植物提供必需的養(yǎng)分，也是很多微生物和小動(dòng)物的棲息地。土壤重金屬鎘含量超標(biāo)會(huì)降低土壤微生物和小動(dòng)物群落豐度，限制植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，嚴(yán)重威脅生態(tài)系統(tǒng)安全［21］。植物可以從重金屬污染土壤中吸收鎘元素，從而降低其在污染土壤中的含量，是一種低成本、可持續(xù)、效率高的土壤修復(fù)方式［22］。草坪草物種多樣性高，耐逆性強(qiáng)，可通過(guò)修剪地上部來(lái)降低土壤鎘含量，是污染土壤植物修復(fù)較理想的選擇。因此，挖掘草坪草耐鎘基因、培育耐鎘和富集鎘的草坪草新品種具有重要意義。本研究以重要的冷季型草坪草-多年生黑麥草為材料，克隆出其B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子編碼基因LpARR10，明確了LpARR10受鎘脅迫誘導(dǎo)的表達(dá)模式，證明了LpARR10的耐鎘功能，豐富了多年生黑麥草耐鎘調(diào)控的分子途徑。LpARR10可作為多年生禾本科草坪草分子育種重要的基因資源。

ARR基因是細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)關(guān)鍵基因，由于其首先在擬南芥中被克隆，因此命名為擬南芥響應(yīng)調(diào)控因子［23-24］。高等植物ARRs 可分為A 和B 兩類，是植物在生長(zhǎng)、發(fā)育和抵御逆境過(guò)程中必不可少的一類轉(zhuǎn)錄因子。A 類ARRs 是細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)負(fù)調(diào)控因子，它可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)B 類ARRs 的磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（arabidopsis his phosphotransfer proteins，AHPs）和抑制B 類ARRs 的轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮負(fù)反饋調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的功能［9］。與A類ARRs 不同的是，B 類ARRs 含有較長(zhǎng)的C 末端和典型的磷酸受體結(jié)構(gòu)域（REC domain of B-type ARRs），具有轉(zhuǎn)錄激活活性，可以激活細(xì)胞分裂素響應(yīng)基因的表達(dá)，發(fā)揮正調(diào)控細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)的功能［10-11］。有研究證明，擬南芥B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子ARR10能夠參與細(xì)胞分裂素通路以調(diào)節(jié)擬南芥的生長(zhǎng)和發(fā)育；ARR10和ARR12參與了細(xì)胞分裂素介導(dǎo)的擬南芥原生木質(zhì)部分化的調(diào)控［25-26］。B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子也能參與生長(zhǎng)素的信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)控生長(zhǎng)素相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而影響植物的生長(zhǎng)、發(fā)育［13］。B 類ARR 家族基因也能夠調(diào)控植物逆境脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而提高植物的耐逆性［14］。但是，B 類ARRs 在耐鎘功能方面尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究克隆得到了多年生黑麥草B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子LpARR10，將其與擬南芥所有ARRs 進(jìn)行進(jìn)化分析，結(jié)果顯示LpARR10 與B 類ARRs 聚為一組，且與擬南芥AtARR10 和AtARR12 的親緣關(guān)系較近。氨基酸序列分析表明LpARR10的C 端較長(zhǎng)，且具有典型的B 類ARRs 磷酸受體結(jié)構(gòu)域（REC domain of B-type ARRs）及金屬和磷酸化結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明LpARR10屬于B 類ARRs。本研究進(jìn)一步在擬南芥中過(guò)量表達(dá)LpARR10，與野生型對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因株系的耐鎘能力顯著提高，說(shuō)明B 類ARRs（LpARR10）正調(diào)控植物的耐鎘功能。本研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中LpARR10上調(diào)表達(dá)的表達(dá)倍數(shù)不同，但它們的耐鎘表型卻沒(méi)有明顯差異，說(shuō)明LpARR10可能存在翻譯后修飾。前人研究表明磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AHPs）能夠磷酸化B 類ARRs，使其變成活化狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能［9-10］。本研究發(fā)現(xiàn)LpARR10 的第 79 位絲氨酸（serine，S）是 B 類 ARRs 成員保守的磷酸化位點(diǎn)，因此，本研究推測(cè)LpARR10的第 79位絲氨酸（S79）是介導(dǎo)AHPs 磷酸化LpARR10的關(guān)鍵位點(diǎn)。利用Crispr/Cas9 技術(shù)對(duì)多年生黑麥草基因組進(jìn)行單堿基位點(diǎn)編輯已經(jīng)實(shí)現(xiàn)［27］，因此，后續(xù)利用Crispr/Cas9 技術(shù)對(duì)LpARR10第79 位絲氨酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，可以明確LpARR10翻譯后修飾的途徑及其發(fā)揮傳遞細(xì)胞分裂素信號(hào)功能的分子機(jī)制。

細(xì)胞分裂素是調(diào)控植物生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老和耐逆反應(yīng)重要的植物激素之一。有研究表明外源噴施細(xì)胞分裂素和細(xì)胞分裂素降解抑制劑能夠提高植物的耐鎘能力［7-8］，然而，其調(diào)控耐鎘的分子途徑尚未可知。本研究發(fā)現(xiàn)，LpARR10基因受細(xì)胞分裂素和鎘處理上調(diào)表達(dá)，并且細(xì)胞分裂素和鎘對(duì)于LpARR10表達(dá)的調(diào)控模式高度一致。例如，在葉中，LpARR10均在細(xì)胞分裂素和鎘處理2 和6 h 時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，其他處理時(shí)間無(wú)顯著差異。在根部，LpARR10的表達(dá)在整個(gè)細(xì)胞分裂素和鎘處理周期均顯著高于0 h，上調(diào)表達(dá)倍數(shù)明顯高于葉部。上述試驗(yàn)結(jié)果表明LpARR10可能是多年生黑麥草響應(yīng)細(xì)胞分裂素和鎘處理的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是細(xì)胞分裂素調(diào)控耐鎘反應(yīng)的關(guān)鍵基因。異源過(guò)量表達(dá)試驗(yàn)也證明，LpARR10的確具有正調(diào)控?cái)M南芥的耐鎘功能。綜上所述，本研究初步明確了細(xì)胞分裂素通過(guò)其信號(hào)傳導(dǎo)通路基因LpARR10發(fā)揮正調(diào)控植物耐鎘的功能。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)克隆多年生黑麥草細(xì)胞分裂素信號(hào)傳導(dǎo)通路LpARR10基因，并根據(jù)進(jìn)化和氨基酸序列分析，發(fā)現(xiàn)LpARR10 與擬南芥B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子聚為一組，且具有高等植物B 類ARRs 高度保守的磷酸受體結(jié)構(gòu)域（REC domain of B-type ARRs）及金屬和磷酸化結(jié)合位點(diǎn)，說(shuō)明LpARR10 為B 類ARRs。定量表達(dá)分析表明，無(wú)論在葉部還是在根部，LpARR10均受細(xì)胞分裂素和鎘處理誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，但在根部上調(diào)表達(dá)的倍數(shù)明顯高于葉部。另外，LpARR10在細(xì)胞分裂素和鎘處理?xiàng)l件下表達(dá)模式較為一致，說(shuō)明其可能是細(xì)胞分裂素調(diào)控植物耐鎘功能的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。異源過(guò)量表達(dá)LpARR10顯著提高了擬南芥的耐鎘能力，表明細(xì)胞分裂素極可能通過(guò)LpARR10調(diào)控耐鎘的功能。該研究結(jié)果對(duì)深入揭示多年生黑麥草B 類ARR 轉(zhuǎn)錄因子的功能，進(jìn)一步培育耐鎘多年生黑麥草的新品種具有重要的理論意義。