蒺藜苜蓿膜聯蛋白MtANN2 基因的表達模式及鹽脅迫下的功能分析

劉亞男 ，于人杰 ，高燕麗 ，康俊梅 ，楊青川 ，武志海 *，王珍 *

（1. 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所，北京 100193；2. 吉林農業大學農學院，吉林 長春 130118；3. 浙江農林大學林業與生物技術學院，浙江 杭州 311300）

植物膜聯蛋白（annexins）是一類進化保守的多基因家族蛋白，通過Ca2+與膜磷脂的結合參與多種生物學過程［1-2］。據報道，水稻（Oryza sativa）有 9個，玉米（Zea mays）有 12個，大豆（Glycine max）有 22個膜聯蛋白編碼基因［3］。研究發現植物能夠通過調節體內膜聯蛋白的表達水平增強自身對逆境的忍受力。例如，蕪菁亞種（Brassica rapa）中分離鑒定出4個膜聯蛋白基因（BrANN1～4），它們均受干旱、鹽和極端溫度的誘導［4］。異源過表達芥菜（Brassica juncea）BjANN2的轉基因煙草（Nicotiana tabacum）對鹽脅迫的耐受性顯著增強［5］。干旱及鹽處理后，小麥（Triticum aestivum）TaANN10和TaANN12的表達量顯著上升［6］。水稻中過表達OsANN3導致植株內的ABA 積累量顯著高于野生型，這意味著OsANN3可能通過ABA 信號提高植物對干旱以及滲透脅迫的耐受性［7］。因此，過表達同源或異源膜聯蛋白基因能增強轉基因植物對高鹽、干旱等逆境的耐受性。相反的，膜聯蛋白基因功能缺失導致植物對逆境脅迫更敏感。如，擬南芥（Arabidopsis thaliana）atann4缺失突變體在鹽脅迫條件下胞質內Ca2+濃度變化顯著低于野生型，同時突變體出現明顯的鹽敏感表型，具體表現為發芽率低及苗期葉綠素含量下降［8］。

在我國，豆科飼草紫花苜蓿（Medicago sativa）種植區域主要集中在北方。為了提高土地利用率，黃淮海地區的鹽堿地廣泛用于種植苜蓿。通常，鹽脅迫會導致植物受到離子脅迫、滲透脅迫、次生脅迫以及氧化脅迫的危害［9］。在鹽漬土壤條件下生長的植物會經歷高滲透脅迫、離子毒性和營養失調，直接造成植物生產力的下降，從而降低作物產量以及牧草品質［10］。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）是目前公布的與紫花苜蓿親緣關系最近的豆科植物，由于其基因組序列已知、基因功能注釋完善，已作為豆科模式物種被廣泛應用于植物基因生物學功能解析和豆科飼草遺傳育種中［11］。目前，對于蒺藜苜蓿膜聯蛋白的研究集中在根瘤的生長調控方面。如，MtANN1基因能被根瘤菌誘導而在根瘤中大量表達，它參與根組織中結瘤因子（Nod 因子）信號轉導的早期階段，并直接調控根瘤生長發育過程［12-13］。本研究克隆了蒺藜苜蓿膜聯蛋白家族成員MtANN2基因，利用原位雜交技術發現了其在根原基特異表達的特點，篩選鑒定了擬南芥同源基因的純合突變體atann2，異位表達MtANN2的atann2成功恢復了表型及對鹽處理的響應。以上試驗結果暗示蒺藜苜蓿膜聯蛋白基因MtANN2可能在植物應答鹽脅迫中起正向調節的作用。因而，MtANN2可作為紫花苜蓿耐鹽分子育種的備選基因。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長

蒺藜苜蓿R108 生態型、擬南芥Col-0 生態型及本氏煙草種子均由本實驗室保存。擬南芥AtANN2（At5g65020）的 T-DNA 插入突變體（CS717982）購自 Arabidopsis Biological Resource Center（https：//abrc. osu.edu/）。蒺藜苜蓿種子破除硬實后，放置于浸濕的濾紙上，4 ℃春化2 d 后放于人工氣候培養箱，待子葉張開后移至1/2 Hoagland 營養液（購自西美杰）中，每周更換一次營養液。擬南芥種子用NaClO（10%）消毒10 min，無菌水清洗 5 次，種在 1/2 MS 固體培養基（15 g·L-1蔗糖和 5.5 g·L-1瓊脂）中，4 ℃春化 2 d 后轉于人工氣候培養箱，待真葉長出后移入土中（營養土∶蛭石=1∶1）。煙草種子播種于土壤中，發芽后移至花盆（每盆1 株），人工氣候室培養4 周。植物培養條件均為：光照16 h/黑暗8 h（22 ℃/20 ℃），相對濕度60%。

1.2 基因克隆、載體構建及植物轉化

根據 Ensemble Plants 數據庫（http：//plants. ensembl. org/index. html）中蒺藜苜蓿MtANN2基因編碼序列（CDS）設計引物MtANN2 F/R（表1），利用Ex Taq DNA 聚合酶（Takara）進行目的片段擴增。將PCR 產物進行瓊脂糖凝膠（0.8%）電泳，經回收純化（TransGen），與pEASY-T5 載體（TransGen）連接后，連接產物轉化大腸桿菌感受態（Trans-T1，TransGen），對菌落PCR 為陽性的克隆進行測序（天一輝遠生物公司），保留序列正確的克隆。連接超表達載體（pCAMBIA1302）方法參照2×Assembly mix 無縫克隆試劑盒（smarter clone），即設計接頭引物1302-MtANN2 F/R 使兩端含有15～25 bp 與線性化載體同源的序列（表1），以MtANN2序列正確的克隆為模板，進行PCR 擴增。利用限制性內切酶Nco Ⅰ和Bgl Ⅱ（quick cut，Takara）雙酶切載體pCAMBIA1302。經無縫克隆酶50 ℃作用15 min，轉化大腸桿菌測序，獲得35S∶∶MtANN2-GFP融合表達載體。將重組子轉化農桿菌（GV3101，華越洋），利用花序侵染法轉化擬南芥。收獲種子（T0代），用潮霉素（hygromycin，10 mg·L-1）篩選轉基因陽性植株，至收獲T2代純合株系。

表1 試驗中所用引物Table 1 Primers used in the study

1.3 植物材料的處理

4 周齡蒺藜苜蓿在NaCl（200 mmol·L-1）處理0、1、2、4、8、12、24 h 后分別收集根系，液氮速凍。擬南芥發芽試驗中，種子消毒后分別種在 1/2 MS 無添加培養基（2.22 g·L-1MS basic 培養基，15 g·L-1蔗糖，5.5 g·L-1瓊脂）（對照）和含有NaCl（100 mmol·L-1）的培養基上（處理），連續7 d 統計發芽率。對根系生長試驗，待擬南芥主根長至2～3 cm 時，選取長勢一致的幼苗移至對照和處理（NaCl，100 mmol·L-1）培養基上，豎直培養10 d 后統計根系生長指標，以對照組中野生型的指標值為1，計算其余數據的相對值。

1.4 突變體鑒定及基因表達分析

參照植物基因組DNA 提取試劑盒說明書（康為世紀），提取擬南芥野生型及突變體的基因組DNA。利用TDNA 上的右邊界引物（RB）和基因特異引物LP 和RP（表1），鑒定純合突變體。植物總RNA 提取參照Promega試劑盒說明書，利用Takara cDNA 合成第一鏈試劑盒進行反轉錄，保存于-20 ℃。采用實時熒光定量（SYBR，Takara）進行擴增（ABI 7300 Real Time PCR System），定量引物序列見表1。試驗樣品均設置3個生物學重復，數據采用 2-ΔΔCt方法［14］計算。

1.5 亞細胞定位

將含有35S∶∶MtANN2-GFP融合表達質粒的農桿菌按照 1∶100 接種于 20 mL 含卡那霉素（50 mg·L-1）和利福平（25 mg·L-1）的 YEB 液體培養基（10 g·L-1胰蛋白胨，1 g·L-1酵母，1 g·L-1MgSO4，5 g·L-1蔗糖）活化至光密度（optical density，OD）=0.6～0.8，再次按照1∶100 的比例二次活化至菌液OD=0.8～1.0，將菌液沉淀（5000 r·min-1，5 min），利用緩沖液（10 mmol·L-1MgCl2、5 mmol·L-12-N-嗎啉代乙磺酸 MES、150 μmol·L-1乙酰丁香酮，pH=5.3）重懸菌體至OD=0.8～1.0，室溫黑暗靜置3 h，利用注射器注射4 周齡本氏煙草下表皮后，培養48～72 h，利用共聚焦熒光顯微鏡（Leica TCS SP8，德國）觀察熒光。

1.6 RNA 原位雜交

原位雜交按照Zachgo［15］的方法操作。簡述如下：將苗齡14 d 的蒺藜苜蓿根經固定、脫水、透明、浸蠟后，包埋于石蠟中，制備根尖石蠟切片（8 μm）。利用 DIG RNA labelling kit（Roche）合成 RNA 探針，其中，帶有 T7/SP6 RNA 聚合酶結合位點的基因特異片段（130 bp）分別轉錄為正義/反義探針（引物序列MtANN2-in situ F/R，表1）。將結構完整的材料經脫蠟，水合后與體外合成的RNA 探針雜交，顯色后顯微鏡下觀察信號。

1.7 生物信息學分析與數據處理

利用擬南芥的膜聯蛋白序列查找蒺藜苜蓿和紫花苜蓿數據庫［16-17］，對所獲得的蛋白序列進行家族成員進化分析，通過 MEGA 軟件（Version 7.0）的鄰接法（neighbor-joining method）構建系統進化樹，自舉值（bootstrap）為1000。通過ExPASy（https：//www.expasy.org/）分析蛋白二級結構；試驗數據利用SPSS 進行統計分析，結果均以平均值±標準誤差表示。利用Power point 2016 和Excel 2016 作圖。

2 結果與分析

2.1 蒺藜苜蓿膜聯蛋白（annexins）家族成員的進化分析

用擬南芥膜聯蛋白（8個）序列檢索苜蓿數據庫，分別比對到17個蒺藜苜蓿膜聯蛋白和66個紫花苜蓿膜聯蛋白。進化分析顯示，相對于擬南芥，蒺藜苜蓿膜聯蛋白與紫花苜蓿成員的親緣關系較近，且通常4個紫花苜蓿膜聯蛋白對應一個蒺藜苜蓿的同源蛋白（圖1），這可能是由于紫花苜蓿基因組加倍造成的。序列分析發現，擬南芥中同源性最高（約為 86%）的 3個膜聯蛋白為 AtANN2（At5g65020.1）、AtANN6（At5g10220.1）和 AtANN7（At5g10230.1），且3個基因都位于5 號染色體上。蒺藜苜蓿中，與這3個膜聯蛋白同源性最高的基因為MTR_0276s0050（該基因尚未定位到蒺藜苜蓿的染色體上），其編碼蛋白與AtANN2 同源性最高（70.65%），因此，將該基因命名為MtANNEXIN2（簡稱MtANN2）。

圖1 擬南芥和2 種苜蓿中膜聯蛋白的進化關系分析Fig.1 Phylogenetic analysis of annexin proteins from Arabidopsis and two Medicago species

2.2 MtANN2 的克隆及表達模式分析

從蒺藜苜蓿擴增到MtANN2的開放閱讀框（948 bp）。該基因編碼315個氨基酸，預測蛋白分子量為35.74 kDa，理論等電點為5.43，平均親疏水指數為-0.526，為親水性蛋白。二級結構以α-螺旋為主（68.25%），此外還含有無規則卷曲（23.49%）及延伸鏈和少量的β-折疊。

實時熒光定量（RT-qPCR）分析蒺藜苜蓿幼苗中MtANN2的表達情況，發現MtANN2在根系中高水平表達，表達量約為地上器官中的3 倍（圖2A）。根系RNA 原位雜交結果顯示，在蒺藜苜蓿側根原基中有MtANN2反義探針雜交的藍色信號，而與正義探針（陰性對照）雜交后根組織中未檢測到明顯的信號（圖2B）。以上結果表明MtANN2主要在蒺藜苜蓿根系尤其是側根原基中表達。

鹽處理（200 mmol·L-1NaCl）蒺藜苜蓿 2 h 后，幼苗中MtANN2的表達水平升高到對照（0 h）的 2.1 倍。處理時間延長至24 h，其表達量基本維持在對照1.5 倍的水平，且差異顯著（P＜0.05）（圖2C）。所以，短時間鹽處理能夠誘導MtANN2的表達。

圖2 MtANN2 的表達模式分析Fig.2 Analysis of the expression pattern of MtANN2 in M. truncatula

2.3 MtANN2-GFP 的亞細胞定位

瞬時表達煙草試驗顯示，對照（35S∶∶GFP）表達的信號分布在煙草表皮細胞核、細胞膜及部分胞質中。重組蛋白MtANN2-GFP 的綠色熒光信號主要位于細胞膜上（圖3），表明MtANN2 是膜蛋白。這與水稻等植物膜聯蛋白的研究結果一致［7，18］。

圖3 MtANN2-GFP 的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of the MtANN2-GFP recombinant protein in N. benthamiana

2.4 擬南芥atann2 突變體的鑒定及表型分析

為了研究MtANN2的功能，本研究篩選鑒定了擬南芥中AtANN2的T-DNA 插入突變體atann2。該突變體植株弱小，長勢緩慢（圖4A）。基因組PCR 鑒定表明，T-DNA 反向插入其第4個外顯子，且該株系為純合體（圖4B、C）。RT-qPCR 結果顯示，atann2中幾乎檢測不到AtANN2的表達（圖 4D）。因此，atann2是該基因的功能缺失突變體。

根系比較試驗顯示，在正常生長條件下，atann2側根數少于野生型，而主根長度差異不明顯（圖4E）。鹽（100 mmol·L-1NaCl）處理后，野生型及atann2的根系生長均受到了抑制，側根數目明顯減少（圖4E）。統計分析結果為，突變體和野生型在處理后相對主根長度、相對側根數目及相對根鮮重均顯著降低，且突變體各指標降低的幅度均高于野生型（37.92% vs. 25.94%；51.78% vs. 26.02%；55.45% vs. 26.00%）（圖4F，G，H）。這說明相對于野生型，atann2缺失突變體對鹽處理更敏感。

圖4 atann2 突變體的鑒定及表型分析Fig.4 Screening and phenotypic analysis of atann2 mutant

2.5 異源表達MtANN2 的擬南芥atann2 植株耐鹽性分析

本研究將35S∶∶MtANN2轉入擬南芥atann2，轉錄水平檢測證明具有潮霉素抗性的陽性轉基因株系中MtANN2高豐度表達（圖5）。選取兩個異源表達株系（Line 6 和Line 11）進行鹽處理，測定發芽率。統計結果表明在正常生長條件下，atann2前期發芽相對緩慢，而異源表達MtANN2的atann2株系與野生型發芽率接近（圖6A）。鹽（100 mmol·L-1）處理導致整體延遲出芽1～2 d，后期4 種基因型種子全部出芽。其中，兩個轉基因株系的趨勢與野生型保持一致，而atann2在第4 和5 天的發芽率顯著低于野生型（圖6A）。上述結果表明，異源表達MtANN2能夠將atann2突變體種子對鹽處理的敏感性恢復到野生型水平。

圖5 異源表達MtANN2 于擬南芥atann2 轉基因材料轉錄水平鑒定Fig. 5 Identification of transcriptional level of MtANN2 in transgenic atann2

圖6 異源表達MtANN2 的atann2 擬南芥對NaCl 的響應Fig.6 Analysis of atann2 ectopically expressing MtANN2 under NaCl treatment

對幼苗根系的分析表明，這兩個轉基因株系的主根長度和根鮮重都接近于野生型，側根數介于atann2突變體和野生型之間，即MtANN2在一定程度上恢復了atann2根系的生長（圖6B）。在鹽（100 mmol·L-1NaCl）處理培養基上，所有植株的生長均受到抑制，轉基因株系的相對側根數目和根鮮重均顯著高于atann2，相對根長介于atann2和野生型之間（圖6C～E）。綜合以上結果，異源表達MtANN2部分恢復了atann2的生長，并增強了轉基因植株對鹽脅迫的耐受性。

3 討論

膜聯蛋白是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的磷脂結合蛋白。近些年來，隨著植物膜聯蛋白家族的發現，關于該家族基因對逆境響應的研究日益增多。水稻、擬南芥、芥菜等多個物種的膜聯蛋白均受到非生物脅迫的誘導［19-21］。同源或異源過表達膜聯蛋白基因在一定程度上增強了轉基因植物對非生物脅迫的忍受力［22-23］。本研究分析了蒺藜苜蓿MtANN2與豆科飼草紫花苜蓿中膜聯蛋白家族基因的進化關系，利用擬南芥atann2突變體材料從分子水平上研究了MtANN2 作為一個典型的植物膜聯蛋白在苜蓿生長及鹽響應中的正調控作用。

蒺藜苜蓿MtANN2基因是典型的植物膜聯蛋白家族成員。在植物進化過程中，膜聯蛋白家族成員逐漸增多。例如，豆科牧草紫花苜蓿中膜聯蛋白數目約為蒺藜苜蓿中其同源基因的4 倍。這可能是由于前者的基因組加倍導致的［17，24］。高等植物中annexins 具有較高的保守性［25-26］。在結構上MtANN2 具有膜聯蛋白家族的核心結構域，即4個“annexin repeat”重復單元（Ⅰ～Ⅳ），且首尾兩個重復單元（Ⅰ和Ⅳ）上均具有潛在的Ca2+結合結構域。其中，Ca2+結合區段通常在重復單元Ⅰ中高度保守，重復Ⅳ中相對可變［27］。另外，像大多數膜聯蛋白家族成員一樣，MtANN2-GFP 主要定位在細胞膜上。這與該家族蛋白通常在細胞膜上作為離子通道介導Ca2+內流，參與植物抗性調節相吻合［28］。由于高等植物膜聯蛋白家族成員眾多，部分成員定位在核膜、細胞核、葉綠體被膜、液泡膜等部位［7，22，29-31］。膜聯蛋白在不同細胞器膜上的精細定位可能與其在植物進化中各成員間功能的精細分工有關。

蒺藜苜蓿MtANN2可能通過在根系中大量表達參與鹽響應。對小麥10個膜聯蛋白基因分析發現，5個在根中高豐度表達，8個基因能夠響應NaCl 誘導［6］。擬南芥中與MtANN2同源性最高（70.65%）的基因為AtANN2。根據 Arabidopsis eFP Browser（https：//www.arabidopsis.org），擬南芥AtANN2在根中的絕對表達量是葉片中的3 倍，遠遠高于其他組織。本研究發現蒺藜苜蓿MtANN2在根中的表達水平是地上器官中的3 倍。擬南芥atann2突變體側根數少，植株弱小，且對鹽處理的鹽敏感性顯著高于野生型。這與其同源基因AtANN4缺失后的突變體表型一致［32］。因此，擬南芥中這兩個膜聯蛋白參與鹽響應。本研究將蒺藜苜蓿MtANN2異源表達于擬南芥atann2，轉基因植物不僅互補了擬南芥atann2的長勢和表型，而且耐鹽性也恢復到接近野生型的水平。本試驗結果從分子水平上證明了蒺藜苜蓿MtANN2 是保守的膜聯蛋白成員，并在植物鹽響應過程中發揮重要作用。這與硬粒小麥（Triticum durum）、棉花（Gossypiumspp.）、擬南芥等物種中的膜聯蛋白能夠增強植物在鹽脅迫下的耐受性一致［33-35］。另外，研究表明膜聯蛋白的Ca2+結合活性為植物響應鹽脅迫提供了途徑，在鹽脅迫下AtANN1、AtANN4可介導Ca2+轉移至胞內，進而激活SOS1 轉運體，調控下游應答基因的表達［32，36］。盡管異源表達MtANN2使atann2的根鮮重恢復到野生型的水平，但是側根數目介于突變體和野生型之間。本研究推測MtANN2在側根原基中高豐度表達可能與側根起始有關。后續對蒺藜苜蓿MtANN2功能缺失突變體和超表達苜蓿植株的耐鹽性分析將豐富該基因的生物學功能。豆科飼草紫花苜蓿有一個膜聯蛋白成員與MtANN2 序列相似性高達97.5%。因此，本研究對蒺藜苜蓿MtANN2的研究結果可以為紫花苜蓿耐鹽分子育種提供理論參考。

4 結論

植物膜聯蛋白（annexins）家族由多個結構保守的膜磷脂結合蛋白組成，通常在植物抗逆中發揮重要作用。本研究針對豆科模式植物蒺藜苜蓿膜聯蛋白基因MtANN2，進化分析表明其編碼蛋白與紫花苜蓿膜聯蛋白同源性較高，組織原位雜交揭示該基因在側根原基中優勢表達。進一步利用其擬南芥同源基因突變體（atann2），異源表達MtANN2成功恢復了突變體植株的表型。同時，外源MtANN2降低了atann2突變體對鹽的敏感性。本結果暗示過表達MtANN2能夠增強植物對鹽脅迫的耐受性。蒺藜苜蓿MtANN2的研究結果對紫花苜蓿耐鹽分子育種具有重要意義。